125I籽源持续照射诱发胃癌细胞株MKN45凋亡的实验研究
[摘要] 目的:探讨胃癌细胞株MKN45在125I籽源的持续作用下发生凋亡的变化,包括细胞形态、早期凋亡率以及Bcl-2、Bax表达的变化,为临床使用125I籽源治疗胃癌提供实验依据。方法:实验组用7粒125I籽源所制成的园盘形状照射源持续照射人胃癌细胞株MKN45,对照组则不予照射,72h后收集各组细胞,分别在光镜、电镜下观察细胞形态, DAPI染色测细胞凋亡率,用流式细胞仪检测细胞的早期凋亡率,RT-PCR检测细胞内的Bcl-2、Bax的表达情况。结果:①实验组各组细胞在光镜、电镜下能观察到凋亡细胞的典型形态上的改变。②DAPI染色细胞凋亡率比对照组高(p﹤0.01)。③实验组细胞的早期凋亡率比对照组高(p﹤0.01)。④RT-PCR检测细胞内的Bax表达明显增强(p﹤0.01)。⑤半定量PCR检测Bax表达明显增强,Bcl-2的表达减弱,实验组的Bcl-2/ Bax的比值低于对照组(p﹤0.01)。结论:125I籽源持续照射能诱发人胃癌细胞株MKN45的凋亡, Bcl-2/ Bax的比值降低可能是人胃癌细胞株MKN45凋亡的机制之一。[关键词] 125I籽源,辐射,人胃癌细胞株,凋亡,Bax,Bcl-2。[中图分类号]Experimental Study on Apoptosis of Gastric Cancer Cell Line MKN45 Induced by Continuous Irradiation from Iodine-125 SeedsAbstractObjective:To investigate the apoptotic effect of iodine-125 seeds on gastric ————————*四川省卫生厅科研课题(编号 080130)资助△ Corresponding author,E-mail:wxt1@medmail.com.cncancer cell line MKN45 and its changes in laboratory,including the changes of cellular morphosis, early apoptotic rate and Bal-2/Bax expression, and to provide further evidence for the clinical application of iodine-125 seeds on gastric cancer.Methods:Human gastric cancer cell line MKN45 in treatment group was continously exposed to discoid radiative sources made by seven iodine-125 seeds,which was not exposed while in control group .72 hours later,the gastric cancer cells in each group were collected, and observed respectively under light and electron microscope. Apoptotic rate were detected with DAPI staining. Early apoptotic rate was detected by flow cytometry(FCM).And Bal-2/Bax expression was detected by RT-PCR.Results: ①Typical morphologic changes of apoptotic cells could be observed under light and electron microscope in treatment group.②Apoptotic rate detected with DAPI staining in treatment group was higher than that in control group,P<0.01.③Early apoptotic rate in treatment group was higher than that in control group,P<0.01.④Increased intracellular Bax expression level detected by RT-PCR was in treatment group, P<0.01.⑤Detected by semi-quantitative RT-PCR, Bax expression level in treatment group highly incresed, while Bal-2 expression decreased.The ratio of Bal-2 to Bax in treatment group was lower than that in control group.Conclusion: Continously irradiation by iodine-125 seeds can induce apoptosis of human gastric cancer cell line MKN45.The decreasing ratio of Bal-2 to Bax may be one of the mechanism of human gastric cancer cell line MKN45’s apoptosis.Keywords : iodine-125 seed; radiation ;human gastric cancer cell line ; apoptosis ; Bax ;Bcl-2.125I籽源是将人造放射性核素125I吸附于银丝或钯丝上,再将其密封于钛管内制作而成,在国外主要用于治疗前列腺癌和颅内肿瘤。随着我国125I籽源和三维计划系统的成功研制,125I籽源已被广泛用于临床。目前有将125I籽源用于治疗胃癌的临床报道[1-6],但125I籽源作用于胃癌细胞的分子机制如何,尚未阐明。为研究125I籽源作用于胃癌细胞的效果和机制,本研究通过将125I籽源持续照射人胃癌细胞株MKN45,观察其实验室变化,探讨125I籽源作用于胃癌细胞的分子机制,为临床使用125I籽源治疗胃癌提供理论依据。1.材料和方法1.1 材料 高糖型(4500mg/L)DMEM培养液(Gibco公司); 6711型125I籽源(宁波君安药业科技有限公司);小牛血清(兰州民海生物);超纯水(Millipore公司Mili- 纯水器,18.2m/cm);人胃癌细胞株MKN45(ATCC);DAPI染料(sigma公司); AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒(凯基生物科技发展有限公司);流式细胞仪(BDFACSAria)(分析用FACSDiVa software);Real time PCR detection system(iCycler iQ,Bio-Rad, USA)。1.2 方法1.2.1 细胞标本的制作 复苏、培养人胃癌细胞株MKN45 ,并进行观察、记数,在光学显微镜和倒置相差荧光显微镜下观察实验前后细胞的形态和细胞核的变化。蓝染细胞率小于5%,证明细胞生长状况良好,才进行实验。取直径35mm的培养皿21个,在其中央放置洁净盖玻片;将培养瓶内处于对数生长期的细胞进行消化、记数,以5×105个/ml的密度接种于直径35mm的培养皿内,共接种21个皿。1.2.2照射模型制作 参照文献[7] 自行设计125I籽源离体照射模型:在聚苯乙烯(polystyrene)材料上制作直径35mm的圆,在圆周上等距离刻6个4.5mm×0.8mm的粒子槽,在圆心上刻1个4.5mm×0.8mm的粒子槽,将粒子放入并固定,见图1。照射时将直径35mm的培养皿对应于照射模型上的圆。每个照射模型和其培养皿构成的照射单元间,以0.25mm厚的铅橡皮进行隔离防护。 图1 125I籽源离体照射人胃癌细胞株MKN45Fig 1 Diagram for 125I seed radiation on human gastric cancer cell line MKN45 in vatro. A:Complete assembly showing cell dish on top of plaque inside protected container. B:Arrangement of seven seeds on the plaque.1.2.3实验分组 将实验分为3个组:对照组(a)、0.9mCi125I籽源组(b)和0.6mCi125I籽源组(c)。a组为3个细胞培养皿,不予照射。两个125I籽源组各有9个细胞培养皿。在125I籽源照射下连续培养72h,后收集细胞。1.2.4 125I籽源对MKN45细胞凋亡的影响 采用胎盘蓝染色法、DAPI染色法及电镜观察各组细胞的凋亡。荧光显微镜下观察100个细胞,统计核物质固缩及形成“核着边”的凋亡细胞数,观察3次,计算出细胞凋亡的百分率。收集细胞5×105个,加PBS液2ml,2000rpm,5min离心,如此洗涤两次。加入500μL Binding Buffer悬浮细胞,再加入5μL AnnexinV-FITC混匀,后加入5μL Propidium Iodide,混匀。 以不加AnnexinⅤ-FITC、PI的细胞作为空白对照管;以单加AnnexinⅤ-FITC、单加PI的两管细胞作为荧光补偿调节对照。 室温、避光、反应15min,1 hour 内进行流式细胞仪(BDFACSAria)检测,分析用FACSDiVa software。每个标本流式细胞仪检测3次,计算细胞的早期凋亡率。1.2.5 Bcl-2、Bax mRNA的表达检测 采用RT-PCR检测细胞Bcl-2、 Bax mRNA表达情况。①反应体系:10×buffer(Mg2+ free) 3 l+MgCl2(25mmol/L)6 l+dNTP(2.5 mmol/L)3.6 l+上游引物(20 mol/L)0.5 l(Invitrogen,上海)+下游引物(20 mol/L)0.5 l+探针或染料(10 mol/L)0.5 l+Taq酶(5U/l)0.2 l(TaKaRa,大连)+ddH2O17.4 l+cDNA模板1 l+Calibration dye 0.3l 共30 l。②扩增条件如下: 94℃ 3min; 94℃ 20sec,51℃ 30sec,72℃ 30sec,共40个循环。③ 熔解曲线条件设置如下: 95℃ 1min,55℃ 1min,55℃ 10s,80个循环,每次循环增加0.5℃。④Bax引物为:5′GGATGATTGCCGCCGT3′和5′CCCAGTTGAAGTTGCCGT 3′,扩增片段长度为91bp,退火温度为51℃。Bcl-2引物为:5’ACAGAGAACCATCCCTATT3‘和5‘GAGAGAATGTTGGCGTCTT3’, 扩增片段长度为401bp,退火温度为51℃。内参照β-actin 的引物为:5’ AAGGCCAACCGCGAGAA3’和5’cctcgtagatgggcaca3’, 扩增片段长度为166bp,退火温度为51℃。⑤结果处理:Bax的Real time PCR产物以相对定量表示。Real time PCR方法:目的基因的量=2-△△CT,在该公式中,Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值,△△Ct = [CtGI(实验组或处理组)-Ctβ-actin (实验组或处理组)]- [Ct GI (对照组) - Ctβ-actin (对照组)]。GI是目的基因,校正样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品。 Bcl-2、Bax半定量PCR结果以半定量检测的Bcl-2、Bax的光密度值与β-actin的比值作为结果统计。1.2.6 统计学方法:结果以均数±标准差表示,行单因素方差分析;方差不齐时采用秩和检验,各实验小组之间的两两比较用LSD检验。Bax荧光定量PCR结果用t检验。α=0.05。2.结 果2.1 台盼蓝染色实验结果 结果见表1、图2。在对照组细胞中,台盼蓝染色可见正常细胞,没有找到凋亡细胞;在实验组细胞中可见大量早期凋亡细胞和典型的凋亡细胞图象。3组细胞死亡率之间的差异,有统计学意义(p=0.006);LSD两两比较,差异有统计学意义。表1 台盼蓝染色细胞死亡率Table 1 Cellular mortality detected with trypan blue stainingGroupnRank sum testPLSD test PabcControl125I seed(0.9mCi)125I seed(0.6mCi)927275.8778±.499445.0630±.281684.9259±.41193.0060.001.000.0010.046.000.0460(a)(b)图2 台盼蓝染色显示125I籽源(0.9mCi)组人胃癌细胞株MKN45Fig 2 Human gastric cancer cell line MKN45 by trypan blue staining.(a)Control group (b)125I seed(0.9mCi) group(A:Early apoptotic cell;B: Typical morphologic changes of apoptotic cell.)2.2 DAPI染色荧光显微镜观察结果 对照组正常细胞核较大,圆形或椭圆形,呈淡蓝色均匀或不均匀荧光,见图3A。经125I籽源持续照射处理过的各组实验组细胞中,均可见不同阶段的凋亡细胞和凋亡小体图象:细胞核明显缩小,呈椭圆形、不规则形或点状,呈蓝色,可见较强的荧光, 见图3B。有的核染色质深染呈裂纹状,染色质边聚;有的核高度深染凝聚、边缘化;有的裂解为高度深染的小圆形或点状碎片。各组间细胞凋亡率差异有统计学意义; 两125I籽源组与对照组间差异均有统计学意义,但两125I籽源组间差异无统计学意义;见表2。表2 各组细胞凋亡率、Bcl-2/BaxmRNA和Bax mRNA PCR结果Table 2 results of apoptotic rate and PCR for Bcl-2/BaxmRNA and Bax MrnagroupnApoptotic rate(%)Early apoptotic rate(%)Bcl-2/BaxmRNABax mRNAcontrol38.67±1.168.80±0.101.49±0.01125I seed(0.9mCi)913.67±1.58*14.03±0.32*1.32±0.13*0.02±0.01125I seed(0.6mCi)914.00±1.87*14.97±1.55*1.15±0.18*0.83±0.29△*P<0.05,compared with control group;△P<0.05,compared with 125I seed(0.9mCi) group BA 图3 DAPI染色显示125I籽源(0.9mCi)组人胃癌细胞株MKN45Fig 3 Human gastric cancer cell line MKN45 by DAPI staining.(a) Control group (b)125I seed(0.9mCi) group2.3 流式细胞仪检测细胞早期凋亡率结果 两125I籽源组与对照组早期细胞凋亡率间差异有统计学意义,但两125I籽源组间差异无统计学意义;见表2。2.4 电镜结果 对照组可见正常形态的人胃癌细胞株MKN45和细胞结构(图4),没有发现凋亡细胞;而125I籽源组的细胞中则可见到核染色质边集(图5A)、细胞器肿胀(图5B)的早期凋亡细胞和细胞体积缩小、核皱缩(图6)的凋亡细胞。 图4 对照组正常胃癌细胞株MKN45(A内质网;B线粒体)放大8000倍Fig 4 Morphology of human gastric cancer cell line MKN45. Control group. Electron microscope.A: endocytoplasmic reticulum;B: cytochondriome.图5 125I籽源(0.9mCi)组人胃癌细胞株MKN45的早期凋亡细胞(A:染色质;B:细胞器) 放大8000倍Fig 5 Early apoptotic cell. 125I seed(0.9mCi)group. Electron microscope.A:chromatin B:organelle图6 125I籽源(0.9mCi)组人胃癌细胞株MKN45的凋亡细胞 放大8000倍Fig 6 Typical morphologic changes of apoptotic cell. 125I seed(0.9mCi) group. Electron microscope.2.5 Bcl-2/Bax mRNA表达半定量PCR结果 将对照组、0.9mCi组、0.6mCi组进行分析,两125I籽源组与对照组间的差异有统计学意义, 但两125I籽源组间的差异无统计学意义;见表2。2.6 Bax mRNA表达荧光定量PCR结果 0.9mCi125I籽源组和0.6mCi125I籽源组间Bax表达差异有统计学意义;见表2。3.讨 论目前,关于125I籽源作用于胃癌细胞的分子机制如何,尚未阐明。已知的研究结果表明,辐射对细胞的损伤有两种结果,间期死亡和凋亡[8] 。有学者报道[9],低剂量率射线的照射下,凋亡是细胞死亡的主要机制。作为低剂量率的6711型125I籽源引起胃癌细胞死亡的主要途径是靠直接杀伤或是诱导凋亡,尚没有文献报道。本实验结果显示,两照射剂量组的台盼蓝染色细胞坏死率,不但没有大于对照组,反而小于对照组,这说明胃癌细胞经125I籽源持续照射72小时后,细胞的死亡率并没有增加。至于对照组的细胞坏死率为什么比照射组的高,我们分析是因为受到照射的培养皿内的细胞的分裂受到创伤,但尚未死亡,只是分裂速度下降而已;而对照组的细胞则因为没有受到损伤,细胞分裂速度没有受到影响,细胞的数量过快增长,代谢产物堆积过多造成了细胞的死亡。因此,125I籽源持续照射胃癌细胞,其作用不是直接杀死胃癌细胞。本实验结果还显示,实验组的胃癌细胞在125I籽源模型持续72h照射后,相差显微镜观察培养皿即可看见较多的凋亡细胞, DAPI染色和电镜下均可以见到典型的处于各个阶段的凋亡细胞,而对照组的细胞里却缺乏凋亡细胞,这说明125I籽源照射后能诱发人胃癌细胞株MKN45的大量凋亡。DAPI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡率均显示0.9mCi照射组和0.6mCi照射组的细胞凋亡率明显高于对照组。目前,有国内外学者报道了125I 籽源作用前列腺癌、肝癌和乳腺癌的可能机制,至于125I籽源作用胃癌细胞的分子机制,尚未见报道。胃癌细胞凋亡的机制迄今尚未完全明了,已知的研究显示有很多基因参与其调节,文献报道Bcl-2和Bax与其较为密切[10,11]。已有的关于基因表达的研究显示,Bcl-2生理功能是阻遏细胞凋亡,延长细胞寿命。Bax是Bcl-2家族中参与细胞凋亡的一个成员,当诱导凋亡时,它从胞液迁移到线粒体和核膜。Bcl-2与Bax两者之间的比例决定了细胞的命运,若Bax占多数,则Bcl-2被抑制,凋亡被诱导,细胞死亡;反之则Bax受到抑制,细胞得以生存[12]。本实验通过半定量PCR检测发现,对照组的Bcl-2/Bax值要高于0.9mCi照射组和0.6mCi照射组。定量PCR检测发现,0.9mCi照射组和0.6mCi照射组的Bax mRNA值与对照组相比明显增高。Bcl-2、Bax mRNA的研究结果表明,胃癌细胞经过125I籽源照射后,细胞内Bax mRNA的表达上调,Bcl-2/Bax值下降。胃癌细胞凋亡的调控中,究竟是Bax mRNA的表达上调占主导,还是Bcl-2/Bax值下降为主,以往的研究显示不清楚。本实验的流式细胞仪检测细胞早期凋亡率和DAPI染色测细胞凋亡率的结果,均显示了0.9mCi照射组和0.6mCi照射组两组之间细胞凋亡率的差异没有统计学意义,两组之间的 Bcl-2/Bax值差异也没有统计学意义,但两组之间的Bax值差异却有统计学意义。也就是说,尽管两照射组之间的Bax值有差异,但是两照射组之间的细胞凋亡率值却并没有差异,说明细胞内单纯Bax值差异跟细胞凋亡率之间没有直接对应关系。实验中两照射组之间的Bcl-2/Bax值与细胞凋亡率之间则成对应关系。我们因此推测,Bcl-2/Bax值的下调,是胃癌细胞凋亡的调控机制之一;单纯的Bax表达上调不是胃癌细胞凋亡的机制。临床上治疗胃癌时, 125I籽源活度大小的选择,一直是人们关注的问题。选择合适活度的125I籽源,在肿瘤细胞得到最大限度杀伤的同时,让肿瘤周围的正常组织的损伤降低到最小,就成了我们研究的课题。本实验设计的0.9mCi照射组和0.6mCi照射组的研究结果显示,两个照射组的胃癌细胞的凋亡率和早期凋亡率虽然与对照组相比是增加了,两照射组间的凋亡率和早期凋亡率值也有不同,但经LSD两两比较差异并没有统计学意义。这就是说,虽然0.9mCi照射组比0.6mCi照射组的籽源活度增加了,但是照射效果却并没有增加。因此,临床上在选择125I籽源治疗胃癌时,在0.6~0.9mCi之间选择时,为了减少不必要的并发症,应该选择低活度0.6mCi的籽源。至于0.6mCi的籽源是不是治疗胃癌的最佳的活度,还有待于做更进一步的研究。参考文献1. 马旺扣,骆永基,曹钟华,等.125碘粒子组织内放疗在肿瘤外科中的应用.陕西肿瘤医学,2002,10(4):241-245.2. 王娟,隋爱霞,贾漪涛,等.单纯放射性 125I粒子植入治疗不能切除的Ⅳ期胃癌9例报告.中国实用外科杂志,2006,26(7):530-532. 3. 邵庆华,罗开元,杨镛,等.胃肠道恶性肿瘤根治术中125碘放射性粒子近距离治疗疗效观察.中国实用外科杂志,2002,22(9):541-542. 4. 毛文源,罗开元,邵庆华,等.125I粒子近距离组织间放射治疗胃癌.中华胃肠外科杂志,2002,5(2):112. 5. 卜延志,徐月华,戴旭东.125I粒子术中植入与腹腔内化疗联合应用治疗胃癌疗效观察.中国医学研究与临床,2006,4(6):50-51. 6. 廖 斌,李 念,徐尔侃,等.碘-125粒子组织间植入配合手术治疗胃肠道恶性肿瘤.四川医学,2007,28(2):199-200.7. Aird EG,Folkard M,Mayes CR,et al. A purpose-built iodine-125 irradiation plaque for low dose rate low energy irradiation of cell lines in vitro.Br J Radiol,2001,74(6):56-61.8. 殷蔚伯,谷铣之,主编.肿瘤放射治疗学.北京:中国协和医科大学出版社,2002:275-275.9. Kroger L,Denardo G,Gumerlock P,et al.Apoptosis-related gene and protein expression in human lymphoma xenografts (Raji) after low dose rate radiation using radioimmunotherapy. Cancer Biother Radiopharm 2001,16(3):213-225.10. Gobe G,Rubin M,Williams G,et al.Apoptosis and expression of Bcl-2,Bcl-XL,and Bax in renal cell carcinomas.Cancer Invsest,2002,20:324-332.11. 高善铃,钱素娟,刘巍.胃癌细胞凋亡及其相关基因的研究.中国肿瘤临床,1999,269(2):632-633 .12. Yin XM,Oltval ZN,Korsmeyer SJ.BH1 and BH2 domains of bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax.Nature,1994,369(3):321-323.