糖尿病性勃起障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌组织形态学及α-SM

糖尿病性勃起障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌组织形态学及α-SMA表达量的变化

崔应东 廖兆琳 胡述彬

（湖北恩施土家族苗族自治州民族医院泌尿外科男科 恩施 445000）

作者简介：崔应东（1970,2-），男，汉族，硕士，副主任医师，主要从事泌尿外科、男科工作。

通讯地址：湖北省恩施市航空路178号恩施土家族苗族自治州民族医院泌尿外科男科

邮政编码：445000

摘要：目的：通过大鼠实验总结糖尿病性勃起障碍阴茎海绵体平滑肌组织形态学和α-SMA表达变化。方法：将20只正常大鼠分为观察组（12只）和对照组（8只）。观察组为糖尿病性勃起障碍大鼠，对照组为正常大鼠。取两组阴茎海绵体组织，采用Masson三色法和免疫荧光化学染色法测定平滑肌/胶原纤维相对含量和α-SMA表达。结果：对照组阴茎勃起率为100%，观察组阴茎勃起率为8.33%。观察组在2.5、5.0、7.5V 电刺激下Max ICP/MAP比值均显著低于对照组（p<0.05）。观察组平滑肌/胶原纤维比值为0.16±0.04，α-SMA表达为0.25±0.17，均显著低于对照组，有统计学差异（p<0.05）。结论：糖尿病性勃起障碍大鼠的平滑肌数量减少，胶原纤维明显增长，α-sma表达受抑。上述情况可能是勃起障碍的主要原因之一。< span="">糖尿病性勃起障碍大鼠的平滑肌数量减少，胶原纤维明显增长，α-sma表达受抑。上述情况可能是勃起障碍的主要原因之一。<-->

关键词：勃起障碍；糖尿病；平滑肌组织形态；α-SMA表达

糖尿病是当前严重影响人们生活质量的主要慢性病之一[1]。男性糖尿病患者往往会合并勃起障碍，起发生率可以高达90%，给男性患者带来了极大的心理和生理痛苦[2-3]。随着研究深入，发现α-肌动蛋白（α-SMA）表达量和阴茎海绵体平滑肌组织对于正常的勃起具有明显影响[4]。本研究以大鼠为材料，探讨了α-SMA和阴茎海绵体平滑肌组织与糖尿病性勃起功能障碍（DED）的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

无特异病原雄性SD大鼠20只。大鼠由我院动物中心提供。体质量220-250个，平均（237±12.4）g。所有大鼠在实验前均证实性功能正常。实验用肝素由上海研生生化公司提供。阿扑吗啡（AP0）、链脉佐菌（STZ）、柠檬酸钠和柠檬酸均由美国Sigma公司进口。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型建立

实验用大鼠均在同一环境正常饲养7d，以适应研究环境。7d后，随机将大鼠分为两组，其中：观察组12只，对照组8只。建模前12h严格禁食，但是不禁水。观察组（DED组）腹腔一次性注射链脉佐菌，标准为60mg/kg。对照组一次性腹腔注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mmol/L，pH4.0）。完成建模后，所有大鼠均在无特异病原环境下喂养8周。在建模第4d和第8周，割尾法取血，并使用美国Johnson&Johnso公司生产的便携式血糖计测血糖，记录大鼠体质量。当观察组大鼠血糖值超过16.7mmol/L，即为建模成功。

1.2.2 DED大鼠筛选和勃起功能测定

取建模成功大鼠，于颈部皮肤松弛处皮下注射APO，标准为100μg/kg。选择安静、昏暗的环境进行勃起功能测定。勃起判断标准：大鼠阴茎头充血、露出、阴茎体增长为勃起。如在30min内未勃起，则为DED大鼠。

按每千克35mg标准腹腔注射0.2%戊巴比妥麻醉大鼠。麻醉成功并固定好后，使用碘伏消毒液消毒相关部位，然后切口颈部皮肤，并让左侧颈静脉充分暴露、插管，以备补液、追加麻药。尽量暴露左侧颈总动脉，插入充满肝素的聚乙烯管，连接张力换能器，使用PowerLab/4SP系统（由澳大利亚ADInstrument公司进口）采集信号。取下腹正中切口，解剖前列腺后侧叶，并暴露海绵体神经，放置不锈钢电极。在电刺激前，需要将有针头并充满肝素的聚乙烯管插入右侧阴茎角部，并连接张力换能器，测阴茎海绵体内压。参数保持在15Hz、脉冲1.2ms，并给予2.5、5和7.5V电压刺激。每次刺激1min，每4min刺激1次。记录Max ICP、MAP，并使用Max ICP/MAP表示。

1.2.3 阴茎海绵体平滑肌/胶原纤维相对含量测定

完成勃起功能测定后，颈椎脱位处死大鼠，并取阴茎中段海绵体组织，完成常规石蜡包埋、切片。Weigert苏木精液染核，Masson丽春红酸性复红液染色。然后使用2%冰醋酸水溶液浸洗。完成后，1%磷钼酸液处理，并使用光绿液复染。95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。胶原纤维需呈蓝色，平滑肌细胞则呈红色。然后使用Image-proplus V6.0进行测定。

1.2.4 阴茎海绵体α-SMA表达测定

采用免疫荧光化学染色法测定α-SMA表达。多聚赖氨酸载玻片，并将石蜡切片贴附载玻片上。烘干、脱蜡、梯度酒精复水、抗原修复。然后滴加一抗置湿盒4℃孵育过夜。PBS洗5次，每次3min。滴加荧光二抗室温置湿盒避光孵育1.5h，PBS洗3次，每次3min。Hoechst 33342避光孵育2min，PBS洗3次，每次1min。含抗荧光淬灭剂封片液封片，并立即在荧光显微镜下观察。细胞内可见绿色荧光物质表达判定为阳性细胞。随机选择每张切片5个视野，在10×40倍显微镜下观察，取平均值计算光密度。

1.3 统计学处理

所有数据使用SPSS18.0进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。< span="">

2 结果

2.1 糖尿病大鼠血糖、体质量变化

糖尿病大鼠STZ诱导前血糖和体质量变化比较见表1。观察组STZ诱导8周后体质量显著低于对照组，血糖值显著高于对照组，有统计学意义（p<0.05）。< span="">

表1 糖尿病大鼠STZ诱导前血糖和体质量变化比较

注：^*表示诱导后与诱导前有统计学差异，p<0.05< span="">

2.2 DED大鼠筛选和ED测定

对照组阴茎勃起率为100%。观察组有1只勃起，勃起率为8.33%。两组在2.5、5.0、7.5V电刺激阴茎海绵体神经后，其Max ICP/MAP比值见表2。在2.5、5.0、7.5V 电刺激下，观察组的Max ICP/MAP比值均显著低于对照组（p<0.05）。< span="">

表2 两组电刺激阴茎海绵体神经后Max ICP/MAP比值比较

2.3 阴茎海绵体平滑肌/胶原纤维相对含量和α-SMA表达

阴茎海绵体平滑肌/胶原纤维相对含量和α-SMA表达比较见表3。观察组阴茎海绵体平滑肌/胶原纤维相对含量和α-SMA表达明显低于对照组，p<0.05，具有统计学差异。两组α-sma表达情况见图1和图2。< span="">

表3 两组阴茎海绵体平滑肌/胶原纤维相对含量和α-SMA表达比较

图1 观察组α-SMA表达（×200）

图2 对照组α-SMA表达（×200）

3 讨论

随着现代生活压力的加大，勃起障碍逐渐成为影响男性生理和心理健康的主要疾病之一[5]。在目前的研究中[6-7]，认为阴茎海绵体重构是导致勃起障碍的主要原因。糖尿病是我国目前发病率较高的慢性疾病之一，而且糖尿病患者多合并有糖尿病性勃起障碍[8-9]。

从本研究的结果来看，观察组大鼠阴茎平滑肌细胞数量较之对照组明显减少。相反，胶原纤维密度则显著提升。这表明糖尿病性勃起功能障碍大鼠海绵体结构和数量发生了较大变化。从平滑肌/胶原纤维的比值变动来看，观察组比值明显低于对照组，这一结果则证实了阴茎海绵体平滑肌细胞含量与勃起功能障碍的严重程度密切相关。换一句话说：阴茎海绵体平滑肌细胞含量越少，糖尿病性大鼠发生勃起障碍的可能性就越大。这一结果与陈俊，胡志明，张滨等[10]的结论是一致的。在他们的研究中，认为小梁内平滑肌细胞的不断减少以及胶原纤维密度的持续增加，将会直接降低海绵体的顺应性，并让海绵窦壁僵硬，让海绵体组织在勃起中不能得到充分的舒张，会阻止动脉血流入，并降低ICP，抑制白膜下静脉的闭合。从本研究的结果来看，平滑肌细胞的减少，会导致致密结缔组织的增长，并诱发勃起功能障碍的发生。

目前的研究已经证实[1，10]：平滑肌细胞具有明显的双向分化功能，而且这种功能是可逆的。按照平滑肌功能和结构的不同，可以分为收缩型平滑肌和合成型平滑肌。对于合成型平滑肌而言，主要起到了增生、迁移、分泌和降解胞外蛋白的作用。合成型平滑肌容易导致诸如动脉粥样硬化等血管病变。α-SMA常见于血管平滑肌肌细胞，被认为是一种反应血管平滑肌表型转化的敏感物质。一旦α-SMA的表达量减少，往往意味着平滑肌正在从收缩型向合成型转化。因此，分析α-SMA的表达对于更好的认识糖尿病性勃起障碍具有重要意义。从本研究的结果来看，观察组α-SMA阳性细胞表达较对照组明显降低。

综合本研究，糖尿病性勃起障碍大鼠的平滑肌数量减少，胶原纤维明显增长，α-SMA表达受抑。上述情况可能是勃起障碍的主要原因之一。

参考文献：

[1] 燕丹.糖尿病性勃起功能障碍的发生机制与治疗进展[J].中国新药与临床杂志，2012,31（10）：583-588

[2] 马福年，蒋睿.自发性高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞培养及鉴定[J].泸州医学院学报，2013,36(1):10-14

[3] 魏来，李欢，林帆，等.细胞凋亡及API5与糖尿病性勃起功能障碍的相关性研究[J].生命科学研究，2013,17（3）：243-247

[4] 郭燕东，冯刚，李天杨，等.粉防己碱对糖尿病性勃起功能障碍大鼠勃起功能的影响[J].湖北民族学院学报（医学版），2013,30（2）：37-39

[5] 陈刚，黄晓军，吕伯东，等.红景天苷对低氧环境下大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞α-肌动蛋白和骨桥蛋白表达的影响[J].中华男科学杂志，2013,19（8）：727-731

[6] 苏宏伟，孙龙云，李向东，等.糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体Cx43 m RNA的表达[J].山东医药，2010,50（45）：27-28

[7] 权伟合，王涛，李明超，等.NOSTRIN在糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体组织中的表达[J].中华临床医师杂志（电子版），2013，7（5）：2003-2007

[8] 韦安阳，刘洋，何书华，等.糖尿病性大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡和增殖特征分析[J].南方医科大学学报，2012,32（2）：155-159

[9] 彭谋，刘全亮，周章彦，等.海绵体注射shIGFBP-3对糖尿病性勃起功能障碍大鼠勃起功能的影响[J].武汉大学学报（医学版），2012,33（5）：635-639

[10] 陈俊，胡志明，张滨，等.糖尿病性勃起障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌组织形态学及α-SMA表达量的变化[J].中国男科学杂志，2013,27（2）：17-20