嘧啶亚硝脲对胶质母细胞瘤A-172细胞Bcl-xL mRNA和蛋白表达及细胞增殖活性的影响

王新军 ^△，武跃辉，李培栋，寿纪新， 刘泉，单峤

郑州大学第五附属医院神经外科 郑州 450052

△ 通讯作者：王新军，博士生导师，主任医师，教授；研究方向：脑肿瘤的基础研究和综合临床治疗，E-mail:wangxj@zzu.edu.cn

关键词：胶质母细胞瘤；Bcl-xL；ACNU；细胞增殖

摘 要: 目的 探讨嘧啶亚硝脲（nimustine，ACNU）对胶质母细胞瘤A-172细胞Bcl-xL mRNA和蛋白表达及细胞增殖活性的影响。方法 用免疫组化染色SP法、RT-PCR和MTT法分别检测对照组和不同浓度ACNU作用于人胶质母细胞瘤A-172细胞后Bcl-xL mRNA和蛋白的表达以及细胞增殖活性的影响。结果 不同浓度ACNU作用A-172细胞后Bcl-xL mRNA相对含量均高于对照组（P＜0.01），随着ACNU浓度的增加，Bcl-xL 蛋白表达逐渐下降，而对细胞增殖活性的抑制率逐渐增高；当ACNU为25ug/ml时细胞增殖抑制率增幅最大为54.48%。结论 A-172细胞中 Bcl-xL mRNA和蛋白的高表达。ACNU可以诱导降低胶质瘤细胞Bcl-xL的表达，促进其细胞凋亡，对A-172细胞增殖活性具有明显抑制作用。

Effection on Bcl-xL mRNA and Protein Expression Induced and Proliferation Inhibitory by ACNU in Human Glioblastoma A-172 Cell Lines

Wang Xinjun¹ , LI Peidong², SHOU Jixin²,ZHAO Hongyang¹ LIU Quan²,ZHAO Zhongwei³, SHAN Qiao²

1） Department of Neurosurgery, the Affiliated Xiehe Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Technology ,Wuhan 430022

2）Department of Neurosurgery,the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Zhengzhou 450052

3）Henan Key Laboratory of Tumor Pathology, Zhengzhou 450052

Key words: ACNU；Bcl-xL； A-172 cells; proliferation

Abstract: Objective The objective of this study was explored the effect of ACNU on the expression of Bcl-xL mRNA and protein and the activity of the proliferation inhibitory in human glioblastoma A-172 cell lines. Methods Human glioblastoma A-172 cells was cultured with defferent ACNU, Bcl-xL mRNA and protein expression were detected by SP immunohistochemical staining and RT-PCR methods,and the activity of the proliferation inhibitory was detected by MTT method. Results The relative content of Bcl-xL mRNA after treated by defferent ACNU were significantly higher than those in control groups(P<0.01), and a significant correlation was found between ACNU dose and the Bcl-xL expressin and the proliferation inhibitory, the expressin of Bcl-xL was decreased significantly and the proliferation inhibitory rate was increased significantly as the dose of ACNU from low to high. the proliferation inhibitory rate was the highest(54.48%) when ACNU is 25ug/ml(P<0.01). Conclusion Bcl-xL mRNA and protein expression were high in human glioblastoma A-172 cell lines.ACNU can decrease the expression of Bcl-xL in A-172 cells,and prompt the apoptosis of A-172 cells,it could effectly inhibit the proliferation of A-172 cells.

亚硝基脲类药化疗作为恶性胶质瘤综合治疗的重要手段之一，但在治疗过程中却发现实际疗效并不十分理想，究其因一是绝大多数肿瘤细胞对化疗药物耐药，二是大剂量给药产生的副作用^[1,2,3]。研究表明：凋亡抑制基因Bcl-xL在正常脑组织中低表达，在胶质瘤组织中高表达，恶性胶质瘤特异性与化疗敏感性有关^[4,5]。但化疗后Bcl-xL表达的变化尚未有研究^[6]。本研究旨在探讨胶质瘤细胞Bcl-xL表达与嘧啶亚硝脲（nimustine，ACNU）的作用关系，以期为解决恶性胶质瘤化疗耐药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及引物

一步法RT-PCR试剂盒购于宝灵曼生物工程有限公司。Bcl-xL引物序列：上游：5’-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3’; 下游：5’-GCGATCCGACTCACCAATAC-3’扩增片段为448bp。β-actin参引物序列：上游：5’-ATGTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’; 下游：5’- CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’， 扩增片段为502bp，以上引物均由北京奥科生物工程公司合成。

1 .2细胞培养

冻存的人胶质母细胞瘤细胞株A-172经37℃水温复苏后接种于25cm2培养瓶中，用加入15%热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基，置37℃、含5%CO2空气及充分饱和浓度的孵育箱内，隔天换培养基，直至细胞铺满培养瓶底。将生长良好的A-172细胞用0.2%胰蛋白酶消化、离心收集后调整浓度为1×10⁶，重新分别接种于预置有盖玻片的24孔板中和25cm²的培养瓶中。并于接种后48h分别加入用RPMI 1640培养液调制成的浓度分别为12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、75ug/ml的ACNU贮存液，对照组细胞培养液中加入二甲亚砜代替ACNU（每组重复5孔/瓶）。每组24h更换培养液，等细胞长满后吸去孔内培养基，经4%PFA溶液固定40min,晾干细胞爬片，进行免疫组化检测。培养瓶中培养细胞经ACNU作用72h后，用Ph7.4的PBS液冲洗，再加入1ml Trizol裂解液充分摇匀，5min后提取RNA进行RT-PCR检测，每组5个复孔。

1.3 不同浓度ACNU作用后A-172细胞增殖活性的测定（MTT法）

将24孔板中的细胞在ACNU作用72h后，在不弃去RPMI 1640培养液的情况下，每孔中加入20ulMTT液，37℃，5%CO2孵育箱内4h，弃去上清液，每孔加入100ul二甲亚砜振荡后，用MTT法，在酶标仪上测550nm处个孔的光吸收值，以细胞琥珀酸氧化脱氢酶（SDH）活性受抑制的情况作为监测方法记录结果。

1.4 A-172细胞总RNA提取 将TRIzol 提取液裂解后得到的细胞转移到无菌、RNase-free的1.5ml离心管中，用吸头反复吹打，振荡后室温静置5min。余下实验步骤严格按照TRIzol试剂所附的操作说明要求进行。最后将所得细胞RNA样品5μl溶于60μl DEPC稀释水中，用紫外分光光度法定量RNA。

1.5 A-172细胞RT-PCR检测

在25μl的扩增体系中分别加入10×RT-PCR缓冲液2.5μl、25mmol/L MgCl25μl、10mmol/LdNTP2.5μl,RNA酶抑制剂0.5μl，AMV逆转录酶0.5μl，bcl-xL上下游引物及内参β-actin上下游引物各1μl,实验样品RNA 1μg，DEPC水25μl。RT-PCR扩增反应条件：50℃ 30min进行RT反应，94℃ 2min灭活RNA酶；变形94℃ 30s,复性58℃30s,延伸72℃ 1 min,共进行30个循环。 取6μlPCR扩增产物在1%的琼脂凝胶中进行电泳1h，紫外线透视仪下观察结果，并用凝胶成像仪分析系统测定灰度值，计算Bcl-xL/β-actin的比值，获得目的片段的相对含量。

1.6 A-172细胞的免疫组化染色

兔抗人bcl-xL蛋白多克隆抗体购于博士德生物工程公司，SP法免疫组织化学染色试剂盒购于武汉博士德生物工程公司。固定后的细胞爬片，逐级经乙醇作用10min后，蒸馏水洗；侵入阻断剂内阻断内源性过氧化物酶，室温孵育30min。在通透液0.1%TritonX-100中冰浴，用10%正常羊血清室温封闭20min。滴加一抗工作液（1：100）；过夜复温，滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，湿盒内室温孵育30min。DAB显色，苏木素复染。实验过程严格按照随试剂所附的说明要求操作进行。用试剂公司提供的阳性组织切片作为阳性对照。，用正常羊血清代替一抗作阴性对照。结果判定：背景不显色，阳性细胞为胞浆内和/或胞膜上着棕黄色颗粒为阳性。阳性判断标准：每张爬片随机计数10个高倍镜视野，计算阳性率并求其平均值，以（x±s）表示。

1.7统计学处理

采用SPSS10.0软件对相应数据进行Ⅹ²检验、t检验、q检验及方差分析,以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 不同浓度ACNU作用下A-172细胞中Bcl-xL mRNA的表达

RT-PCR检测结果见图1，由图1可以看出，内参为502bp的条带，目的基因Bcl-xL mRNA为448bp的条带。Bcl-xL mRNA的相对含量详细见表1。

表1 ACNU对A-172细胞Bcl-xL mRNA表达和SDH活性抑制率的影响

组 别 n mRNA相对表达量 抑制率%

对照组(A) 5 1.13±0.23 0 12.5ug/ml ACNU (B) 5 0.98±0.21 26.13 25ug/ml ACNU (C) 5 0.54±0.20 54.48 50ug/mlACNU（D） 5 0.48±0.18 62.01 75ug/mlACNU（E） 5 0.37±0.19 74.34

注： B:A P<0.05；C:A，D:A，E:A均P<0.01

2.2 不同浓度ACNU作用下A-172细胞SDH活性的抑制作用

不同浓度ACNU作用后对A-172细胞SDH活性抑制作用的监测结果由表1可见，随着ACNU浓度的增加，对细胞增殖活性的抑制率逐渐增高，具有一定的剂量依赖，与对照组相比差异显著。同时也见，当ACNU为25ug/ml时，即可抑制54.48%的细胞增殖，此后随着ACNU浓度增加，对细胞活性的增殖抑制率递增幅度明显减小。

2.3 ACNU作用后A-172细胞Bcl-xL 蛋白的表达

免疫组化染色阳性着色呈棕黄色颗粒，定位于细胞浆内。不同浓度的ACNU作用后A-172细胞Bcl-xL蛋白的表达情况见图2。从对照组可以看出，A-172细胞内Bcl-xL 蛋白高表达。随着ACNU浓度的增加Bcl-xL 蛋白表达逐渐下降。

A

B

C

E

D

图1 对照组(A)及不同浓度12.5ug/ml(B)、25ug/ml(C)、50ug/ml(D)、75ug/ml(E) ACNU作用72h后Bcl-xL蛋白的表达（A-172细胞爬片，SP法,×400）

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，目前胶质瘤的治疗仍然是手术、放疗和化疗。胶质母细胞瘤恶性程度最高，生长迅速，切除后复发率几达100%，对于预防和治疗术后复发，化疗仍是一个重要的手段，它已经成为恶性胶质瘤综合治疗的重要组成部分。然而，像全身大多数恶性肿瘤一样，恶性胶质瘤对化疗的敏感性较低，亚硝脲类药物（ACNU）由于其高度脂溶性，容易通过血脑屏障，可在肿瘤细胞内释放出活泼的烷化基团，造成肿瘤细胞的DNA损伤，最终导致肿瘤细胞死亡，是治疗脑瘤的首选药物，其有效率仅20%^[7,8]。化疗耐药是化疗药物疗效偏低的主要原因，是肿瘤治疗的一大难题，也是恶性胶质瘤综合治疗失败的一个重要原因^[9,10]。现代研究表明：化疗药物发挥杀伤作用的重要机制是诱导肿瘤细胞凋亡，而凋亡抑制基因的过度表达抑制了肿瘤细胞的凋亡，并与化疗耐药有密切关系^[11,12]。

已有研究发现，Bcl-xL基因高表达提高了肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，通过促进基质蛋白酶的合成、分泌和活化提高了恶性肿瘤浸润性生长的能力^[13,14],也提高了肿瘤细胞的增殖能力^[15]。本研究发现：在A-172细胞中Bcl-xL是高表达的；用不同浓度的ACNU作用于胶质母细胞瘤A-172细胞后，无论是Bcl-xL mRNA的相对表达量，还是Bcl-xL蛋白的表达水平都随着ACNU浓度的增高而降低，存在显著的统计学意义，提示ACNU可以明显地诱导降低胶质瘤细胞Bcl-xL的表达。同时通过对A-172细胞SDH活性抑制作用的监测也发现，随着ACNU浓度的增加，对细胞增殖活性的抑制率逐渐增高，并且具有一定的剂量依赖，说明ACNU可以有效地抑制A-172细胞的细胞增殖，并进一步提示25%ug/ml的ACNU可以作为有效抑制胶质瘤细胞株A-172细胞增殖的最佳化疗药物浓度，从而可以减少因剂量引起的化疗药物毒性作用，增加化疗效果。

综上所述，ACNU可以通过诱导降低胶质瘤细胞Bcl-xL的表达，促进其细胞凋亡，对A-172细胞增殖活性具有明显抑制作用。由此可以推测，A-172细胞中 Bcl-xL的高表达，可能是引起肿瘤细胞对ACNU个体化疗耐药的重要因素之一。这将为胶质瘤的综合治疗提供重要的理论依据。