RNA干扰的抗病毒作用：阻止乙型肝炎病毒复制的新策略

世界感染杂志2004年第4卷第6期

王新宇，尹有宽，张继明

作者单位 上海复旦大学附属华山医院

摘要：近年来，科学家们发现了一种普遍存在的重要的基因调节机制，被称为RNA沉默或者是RNA干扰(RNAi)。虽然RNAi基因调节的机制并没有完全搞清楚，但科学家已将研究的重点放在治疗作用上，特别是抗病毒作用。本文介绍了近年利用小干扰RNA(siRNA)阻止乙肝病毒复制的多个成功的体内和体外研究。这些研究使我们离使用RNAi作为一种抗病毒治疗的手段越来越近。
关键词：RNA干扰； 乙型肝炎病毒；抗病毒治疗
中图分类号：R373．2：R453 文献标识码：A
Abstract：In l~cent years，the scientists discovered a major and universal mechanism of gene regulation called RNA silencing or RNA interference (RNAi)．Although the mechanism by which RNAi controls gene regulation is only partly understood，considerable interest is focusing on the putative therapeutic applications of these molecules，particularly for fighting viral infections．In this article，the successful researches on blocking replication of hepatitis B virus in vivo and in vitro by short interference RNA (siRNA) were demonstrated．These researches bring US one step closer to the use of RNAi as all antiviral therapy．
Key words：RNA interference；hepatitis B virus；antiviraltherapy
1 RNA干扰概述
RNA干扰(RNAi)是指由双链RNA (dsRNA)启动的序列特异性的转录后基因沉默现象(PTGS)。研究者首先在秀丽杆线虫中发现了这种现象【l1，他们先后用直接向线虫注射dsRNA，将线虫浸泡在dsRNA液体中以及通过喂食线虫由细菌产生的dsRNA等方式沉默了在线虫体内的基因。使用长链的dsRNA的实验在线虫中获得成功后，人们又成功地用21．25bp大小的小干扰RNA (siRNA)进行了实验。它是dsRNA被一种称为Dicer的RNaselII家族的酶所分解后产生的短链RNA【2】。siRNA在与酶复合体RISC(RNA介导的沉默复合体)结合展开后，又在RISC的协助下，根据Watson．Crick碱基配对的规则来选择目标RNA，与siRNA同源的靶RNA将被降解【31。RNAi的过程在经过少量改动后成功在哺乳动物细胞中得以实现。与线虫不同的是，因为长链dsRNA会诱导哺乳动物细胞产生非特异性的干扰素(IFN)，而后者又会激活蛋白激酶PKR ，所以长链dsRNA不能直接在哺乳动物细胞体内起作用。但随着人工合成长度大约为2l碱基的两端有2或3个核苷酸(nt)突出的短RNA二聚体获得成功后，这一问题迎刃而解。Elbashir等利用这个方法成功抑制了内源性的核纤层蛋白A／C基因以及肿瘤抑制基因p53的表达【3I。此后人们又利用这一方法成功沉默了一系列的内源性哺乳动物基因。
2 RNAi的抗病毒作用
除了沉默细胞基因外，利用RNAi来抑制病毒RNA也有着美好的前景。事实上，在植物中RNAi是抵御病毒入侵的一种自然防御机制。在病毒复制过程中，双链RNA中间体的出现被认为是诱导RNAi的机制。最近，RNAi已经成功地在数种不同的哺乳动物细胞中抑制了病毒复制。Bitko和Barik[51利用siRNA沉默了由呼吸道合胞病毒(RSV)产生的mRNA，RSV 是一种引起呼吸道疾病的负链病毒。但由于RNA和病毒结构蛋白结合影响了siRNA的作用，该文的作者并没能成功地抑制全长的病毒RNA。最近，又有多个研究将RNAi的目标瞄准了HIV。在体外模型中，siRNA或者直接针对HIV病毒，或者针对编码HIV．1重要的辅助受体CXCR4／CCR5的RNA。RNAi已经成功抑制的其它病毒还包括登革热病毒、兽棚病毒(FHV)、恒河猴病毒(RRV)、森林脑炎病毒(SFV)、流感病毒和脊髓灰质炎病毒。有趣的是病毒也能对RNAi产生耐受。已经发现丁肝病毒(HDV)能够抵御Dicer的作用[6】。在果蝇细胞中，FHv可以抵抗RNAi【7J。最近的文章发现分别由痘苗病毒和流感病毒编码的E3L和NS1蛋白产物可以抑制RNA沉默[8】。在植物中同样也是如此，有一些蛋白，例如黄瓜花叶病毒的2b，双粒病毒的AC2，马铃薯病毒的HcPro，南方菜豆花叶病毒的Pl，番茄丛矮病毒的p19都能抑制基因的沉默。这些现象的神秘机制正在慢慢地被解开。例如通过X线晶体衍射成像的方法，我们了解到了番茄丛矮病毒的p19的精确结构f91，发现p19正是利用序列非依赖性的识别，与19—21nt的siRNA结合，从而抑制了RNAi。
3 RNA干扰与干扰素关系的研究
与原来认为RNAi与干扰素途径无关的观点不同，最近的研究发现siRNA和shRNA可能激活了干扰素(IFN)途径，而这个过程导致非特异性地阻断了蛋白合成和全部RNA的降解。利用合成的siRNA进行RNAi试验时，Bridge[10和Sledz[111等检测到了52种常见的由干扰素诱导的基因表达都增高了至少两倍，显示出这些非特异性的效应可能依赖于干扰素途径中补体的作用。Bridge等在利用DNA载体为工具的RNAi研究中发现2’5’一寡腺苷酸合成酶(OAS1)的水平提高了500倍，而OAS1是IFN途径的一个重要产物。这些资料也表明IFN既存在于siRNA序列也存在于以DNA载体为媒介的RNAi过程中。有趣的是，在一项研究中发现针对HCV的siRNA并不激活IFN 途径 】。这个现象可能的解释是该研究选用了Huh一7细胞系，而在先前的研究中已经发现这个细胞系对于dsRNA 信号有缺陷。在动物体内的RNAi研究中迄今尚无IFN相关副作用的报道。但这并不意味在体内试验中不存在这方面的问题，而是说明还没有人引起重视。在治疗性的研究中，研究者必须先知道研究对象可耐受的干扰素系统活性以及siRNA的最低有效剂量，因为RNAi诱导的非特异性的IFN有可能依赖于siRNA的数量。另一个最新的发现是在特定的情况下RNAi也会有IFN非依赖性的沉默效应。Jackson利用一个优化的基因表达方法，发现除了部分预计中的靶位，siRNA还可以抑制很多其它基因。Scacheri等f1 峻现，针对MEN1基因的不同siRNA还能分别不同程度改变p21和p53的蛋白水平，而这种效应与siRNA的剂量并无关系。
由此可见，在RNAi应用到临床研究前，需要更多的研究来解决IFN相关的沉默效应。
4 RNAi抑制乙型肝炎病毒的复制的研究
乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝病毒属，这个属的病毒通常只感染肝细胞。虽然乙肝疫苗已经应用了相当长的时间，但一部分慢性HBV感染的病人还是会进展成为肝细胞性肝癌(Hcc)。据估计，全世界每年大约仍有100万人死于HBV相关的疾病。HBV基因组是一条3．2kb长，部分双链结构的DNA。其中核心基因编码前C (HBeAg)和C(HBcAg)，多聚酶基因(P)编码多聚酶，后者是逆转录(RT)的关键酶，表面蛋白基因编码前Sl、前S2、和S(HBsAg)，X基因编码X蛋白。四种不同的mRNA编码了上述的蛋白，它们均是由HBV DNA产生，大小分别为3．5、2_4、2．1和0．Tkb【l 。3． 5kb转录子除了编码前C和HBcAg，还作为逆转录的模板。
目前，针对慢性乙型肝炎感染至少有两种不同的抗病毒治疗选择。第一种是0c一干扰素，但它被公认为只是在有限的病例中有效f1 。另一个选择是核苷类似物，例如拉米夫定(3TC)、阿德福韦，法昔洛韦以及喷昔洛韦。虽然这些药物有效地使病人血液中的病毒载量降到了低于检测水平的程度，但是持久的病毒学反应却还远不能令人满意f1”。因此，人们需要新的武器来对付这种疾病，RNAi无疑是‘个不可多得的选择。在下面几个将要提到的研究中，它已经有效地抑制了病毒的复制Konishi等f】 通过化学合成siRNA的方法在一种能够持续产生HBV感染颗粒的肝癌细胞系中成功地抑制了病毒复制。研究通过测定细胞分泌在培养液中HBsAg的滴度，来评价RNAi抑制病毒的效率，发现针对多聚酶区的siRNA为78％，针对S区的siRNA为42％，而作为阴性对照的随机siRNA不能起到沉默RNA的作用。这一结果显示靶区域的选择在RNAi过程中起到了重要的作用。但是目前来看，尚无系统的方法能够有效地预测哪些靶位更有效。Hamasaki等【】 用针对核心区的siRNA 与全长HBVDNA质粒共转染进入Huh一7和HepG2细胞并以针对绿色荧光蛋白(GFP)的siRNA作为阴性对照的研究中发现HbeAg水平下降了5倍，Southern印迹试验也证实了病毒复制的下降。Ying 伽使用了两种不同的细胞系：一种产生野生株的HBV，另一种产生针对拉米夫定耐药的HBV。当应用了针对核心区域的siRNA后，利用实时定量PCR测定发现两种细胞系的病毒水平皆呈剂量依赖性的下降。Shlomai和Shault 利用一种以质粒为载体的RNAi来抑制HBV。这种方法是通过位于该质粒H1RNA启动子后的短发卡状RNA (shRNA)的表达，来起到与siRNA相同的作用。这些shRNA同样也抑制了在持续表达病毒颗粒的细胞中HBV病毒的复制。这项研究的靶位选择了核心基因和x基因。研究首先构建了能够针对上述靶位的质粒，然后利用这些质粒转染细胞进行RNAi，发现能够在Western蛋白杂交中明显降低蛋白的表达。研究还发现了siRNA要求高度的序列特异性，发生变异的序列将不能够抑制蛋白的表达。Klein 的研究又进了一步，他们成功地在小鼠模型中抑制了HBV。首先，他们通过液体泵尾静脉注射的方法向小鼠体内注射了具有复制功能的HBV DNA载体，使小鼠血液中产生了HBsAg和HBeAg。接着，他们利用RT—PCR方法测到了病毒mRNA，还使用免疫组化的方法确认了病毒在肝细胞中的复制。当含有HBV基因的质粒和针对s基因或者是核心基因的siRNA 一起注射入体内后，与只注射HBV载体的对照组相比小鼠HBsAg或HBeAg的水平都大约下降了2／3。他们还发现针对表面蛋白基因的siRNA可以在体内持续抑制作用较长(最长到1ld)，而针对核心基因的siRNA只能有较短的反应时间(3—5d)。这个结果再次表明目前很难通过靶序列来预测siRNA的有效性。
MaCafrey等 以质粒为载体，利用RNAi方法成功在小鼠体内抑制了HBV。他们设计了7条分别针对HBV不同区域的shRNA，他们发现除1条外，其余6条都有效降低了Huh．7细胞培养液中HBsAg的含量。在8d的培养后能够抑制HBsAg超过90％的两条shRNA被用来进行下一步的小鼠体内试验。这些通过尾静脉注射入小鼠体内的的质粒不但抑制了HBsAg和HBcAg，而且也抑制了病毒的复制。其中一条shRNA在体内试验中还显现出了非特异性沉默效应。虽然这条shRNA设计针对的靶位是HBV3．5．kb转录子，但是它也能够抑制2．4．kb和2．1-kb的转录子。虽然这种序列非依赖的沉默效应增强了抗病毒的效果，但在实际的RNAi治疗中这种非特异性的沉默并不是研究人员期望得到的。Giladi等 研究发现直接针对HBV中S基因siRNA不但能够在体外而且还能在小鼠体内抑制HBV 抗原和DNA水平。他们还发现与核苷类似物需要在病毒复制活跃期才能起作用不同，当给小鼠注射复制功能缺陷的HBV质粒后，siRNA治疗仍能取得很好的效果。
6 总结与展望
本文所述的研究显示RNAi可以抑制HBV。细胞培养和动物体内研究都证明了这个观点。但是合成的siRNA 只能显示出短暂的反应，而基于质粒的方法能够获得一个较为持续的效果。研究者通过观察发现，通过尾静脉给小鼠注射的siRNA对肝脏有很高的亲和力 ，这可能是因为乙型肝炎病毒主要是在肝脏中进行复制的缘故。另一种可以选择的方法是针对细胞的基因进行RNAi。Song等发现在自身免疫性肝炎的小鼠中，针对细胞表面Fas受体的RNAi可以有效保护肝脏，防止肝细胞损伤和肝纤维化L2 。与其它治疗的方法类似，有效的给药途径是RNAi进入临床试验的最大障碍。理论上来说，病毒载体可以有效地传递shRNA。对于siRNA来说，在血管中的不稳定性值得大家注意。siRNA通过化学修饰可能可以延长其半衰期。另一种方法是让siRNA 脂质体复合物与短肽片段结合，而这些短肽片段能够与肝脏特异性的受体结合。虽然液体泵尾静脉注射是一种在小鼠中广泛应用的方法，它可以快速的将动物体积1／10的液体注入动物体内 ，并且在一些非人灵长类动物的DNA导入试验中也初步获得了成功 ，但是这种方法距离临床应用还有很长的距离。我们在基于DNA的基因治疗和反义核酸技术领域，还需做出更多的努力以获得更理想的给药途径。
RNAi对于靶区域的错配有着极高的敏感性。研究显示，即使是一个碱基的错配也可能导致RNAi活性的丧失，因此RNAi用于治疗时，另一个严峻的问题是病毒只要发生一个碱基的变异便能产生耐药。在HCV方面，这个问题显得尤为突出，HCV中RNA依赖的RNA多聚酶(RdRP)由于缺乏校读功能，当复制时会产生大量的错误。这类问题也已经在脊髓灰质炎病毒中观察到，近来在HIV中这类问题出现得更多。HBV基因组序列虽然相对HCV来说比较保守，变异比较少，但在3TC 应用于治疗慢性乙型肝炎前，谁又能料到YMDD变异会成为其发生耐药的关键。另一个可能出现的问题是当不能完全抑制病毒时，残余的病毒可能会反跳。以慢性丙型肝炎的病人为例，通常病人血液中的病毒载量在l0 到l0 基因组拷贝／mL之间，也就是说即使RNAi治疗成功抑制了90％的病毒RNA，残余的病毒依旧足够利用靶区域的突变而产生耐药。这样看来，同时选择多个靶位的混合siRNA或者RNAi协同如核酶以及反义核酸技术作为一种联合治疗的手段来对抗病毒可能会取得更好的疗效。
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