论文精选
发表者:尹有宽 人已读
肝脏2003年6月第8卷第2期
拉米夫定耐药HBV毒株的RT区序列分析
张继明 尹有宽 卢清 张清波 邬祥惠 翁心华
【摘要】 目的 分析拉米夫定耐药HBV毒株部分RT区序列,以了解RT区YMDD基序之外HBV的变异情况。方法采用PCR方法对拉米夫定临床耐药患者治疗前及耐药后血清I-IBV部分RT 区序列进行扩增,扩增的核苷酸片段覆盖I-IBV RT 的B区~E区及S基因“a”决定簇,对PCR产物进行直接测序,将HBV RT 区核苷酸和推导的氨基酸序列与治疗前5O株HBV 野毒株序列和Genebank中77株不同基因型野毒株序列进行比较,同时对HBV进行血清分型。结果60例患者有YMDD 变异,其中26例为adw 亚型,占43.33%;34例为adr亚型,占56.67% 。另外12例患者 (16.67% )未发现YMDD变异。16例患者出现11个RT保守区氨基酸变异(不包括550和526位氨基酸变异);25例患者出现19个HBV RT 非保守区氨基酸变异。结论 拉米夫定耐药株的氨基酸变异不仅见于RT B区的526和C区550 两个位点,B、C区的其他位点、保守区以及RT非保守区也可发生多个变异。【关键词】 乙型肝炎;拉米夫定;YMDD基序变异 Analysis of partial RT region sequences of lam ivudine-resistant HBV strains from patients with chronic hepatitis B ZHANG Jiming,yIN Youkuan,LU Qing,et a1. Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040 【Abstract】 Objective To analyze the partial RT region sequences of lamivudine—resistant HBV strains from patients with chronic hepatitis B and to evaluate the amino acid variances outside HBV YM DD motif.M ethods 72 patients with chron— ic hepatitis B treated by lamivudine for over 1 year were included in the study.All the patients had brea kthrough of serum HBV DNA levels and ALT flare up and were clinically diagnosed as being lamivudine—resistant. Partial RT region sequences of lamivudine—resistant HBV strains and pretreatment HBV wild strains were amplified by PCR using specific primers flanking B—C regions of RT and .a determ inant of S gene. Nucleotide and predictive am ino acid sequences were compared with wild—type FIBV sequences from pretreatment serum samples and Genebank. Results YM DD m utations occurred in 60 patients with chronic hepatitis B,26(43.33%)with serotype adw,34(56.67% )with serotype adr,the rest of the patients(16.67%)had no YMD D m utation.1 1 am ino acid variances in conserved regions of RT other than variances at am ino acid position 550 and 526 were found in 16 patients.An additional 19 am ino acid variances in non—conserved regions of RT were also detec ted in 25 patients.Conclusion Lam ivudine-res istant HBV strains m ay harbor several amino acid variances .not only in the non—co nserved regions of RT .but also in the conserved regions outside Y MDD m otif.【Key words】Hepatitis B;Lamivudine;YMDD motif mutation 近年来,YMDD基序之外变异的研究受到了重视。已发现RT 保守区的其他变异,如A527T、 A546V、V553I变异也与拉米夫定耐药有关. 。此外, RT非保守区的某些变异可补偿YMDD变异株的低复制能力,导致YMDD变异株复制增强_2j。本研究通过分析临床上获得的拉米夫定耐药HBV毒株部分RT 区序列,并与拉米夫定治疗前的野毒株序列进行比较,以了解RT区YMDD基序之外HBV的变异情况。一、病例和标本材料与方法 病例为2000年10月至2002年5月在我院门诊治疗及随访的慢性乙型肝炎患者,共72例,全部符合 2000年西安会议制定的慢性乙型肝炎的诊断标准。患者接受拉米夫定治疗1~5年,平均1.5年,并符合临床耐药诊断标准:(1)血清HBV DNA转阴后又出现HBV DNA反跳,至10 拷贝/mL以上;(2)排除拉米夫定治疗过程中患者依从性差而引起的HBV DNA 反跳;(3)排除其他原因引起的ALT升高。32例患者用非基因测序方法(RELP、基因芯片、荧光PCR等方法)检测出YMDD变异。所有患者留取出现耐药时的血清标本,其中50例患者留有治疗前标本。血清标本于一70℃ 冰箱内保存。二、病毒学检测维普资讯 http://www.cqvip.com 肝脏2003年6月第8卷第2期血清HBV DNA定量采用荧光定量PCR方法,药盒购自达安公司,在PE5700扩增仪上进行操作。三、HBV RT区序列扩增和测序根据HBV P基因的保守区序列,自行设计一对引物。扩增的核苷酸片段,覆盖B区~E区。引物序列如下:上游引物:5 一GTA TGT TGC CCG TTT GTC CTC-3 (nt461~481);下游引物5 一CC F TGA CAT ACT TTC CAA ATA一3 (nt997~974),引物由上海申友公司合成。血清HBy DNA 的提取按文献进行 J。 PCR的反应体积为50 l,反应条件是94。C预变性 3min;94。C 30s,56。C 30s,72。C 45s,循环35次,最后 72。C 7min。取PCR产物5 l进行琼脂糖凝胶电泳,对扩增产物进行初步鉴定。阳性的PCR产物纯化后,直接在ABI377型DNA 自动荧光测序仪上进行测序。测序标本共122份,其中拉米夫定耐药株序列72份,治疗前野毒株序列50份。四、HBV参照序列参照序列包括GeneBank中不同基因型HBV 全基因序列77份;从治疗前临床标本中获得的序列50 份。截取HBV 全基因序列中两条引物之间序列,用于序列分析。五、HBV血清分裂由于HBV的S基因完全与P基因重叠,而本文设计的P基因引物的扩增片段包括S基因的“a”决定簇,因而可用于HBV血清分型。根据S基因122位氨基酸的赖氨酸 氨酸(AAG/CGG)判断d/y的特异性;以S基因160位氨基酸的赖氨酸/精氨酸(AAA/ AGA)判断w/r的特异性。六、拉米夫定耐药HBV RT区序列分析核苷酸序列分析采用NTI Vector 5 5分析软件,将拉米夫定耐药患者HBV RT区核苷酸序列、推导的氨基酸序列与慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗前及 GeneBank中不同基因型HBV RT 区核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行比较,以发现RT 区内可能与拉米夫定耐药有关的新的氨基酸变异。结 果一、血清HBV DNA水平 72例拉米夫定耐药患者HBV DNA水平平均为 (6.09±0.12)Log,拉米夫定治疗前HBV DNA水平为(7.83±0.24)Lo g,耐药后HBV DNA水平低于治疗前(P<0.05),但有5例拉米夫定耐药患者的HBV DNA水平高于治疗前。二、HBV血清型 · 29 · 72例慢性乙型肝炎患者中,31例为adw亚型,41 例为adr亚型,未发现其他亚型。在60例有YMDD 变异的患者中,26例为adw亚型,占43.33% ;34例为 adr亚型,占56.67%(见表1)。adr亚型所占比例高于 adw亚型,但差异无显著性(P>0.05)。三、HBV耐药株YMDD变异及类型在诊断为拉米夫定临床耐药的72例患者中,60 例有YMDD 变异。变异类型有3种,即M550I、 M550I+L526M 和M550V+L526M ,所占比例分别为 40% 、13.33%和46.67%。在有YMDD变异的34例 adr亚型患者中,M550V+L526M 变异占55.88% ,明显高于其他2个变异类型(M550I变异占29.41% , M550I+L526M 占14.71%)。在有YMDD变异的26 例adw亚型患者中,M550I变异占53.85% ,明显高于其他2个变异类型(M550I+L526M 占11.54% , M550V + L526M 占34.62%)。另外12 例患者 (16.67%)尽管临床上诊断为拉米夫定耐药,但未发现 YMDD变异,其中3例患者存在单独L526M 变异。 HBV耐药株YMDD变异及类型见表1。表1 HBV 耐药株YMDD变异及类型四、拉米夫定耐药HBV RT保守区氨基酸变异通过分析72例拉米夫定临床耐药患者HBV RT 保守区核苷酸和推导的氨基酸序列,并与参照序列进行比较,发现60例有C区YMDD基序550位氨基酸变异(M550I或M550V),其中36例伴有B区L526M 变异;17例患者存在l1个非550和526位氨基酸变异(见表2),其中12例伴随YMDD变异而出现,5例不伴有YMDD基序变异。在l1个RT保守区变异氨基酸中,3个(A527T、A546V、V553I)曾被报道与拉米夫定耐药有关. ,其他8个氨基酸变异尚未见报道。五、拉米夫定耐药HBV RT非保守区氨基酸变异通过与参照序列进行比较,结果发现,25例患者 HBV RT非保守区共有19个氨基酸发生变异,其中 16例伴有YMDD 变异,9例不伴YMDD 变异(见表 3) 讨 论拉米夫定的长期应用易产生耐药性是其主要的局维普资讯 http://www.cqvip.com · 30 · 表2 I--IBV RT保守区氨基酸变异 ’不包括常见的L526M 、M5501/M550V 变异;” 已报道与拉米夫定耐药有关;. 不伴YMDD基序变异表3 HBV RT非保守区氨基酸变异限。文献报道,治疗1年的耐药率为16% ~32% ,治疗3~4年的耐药率可达49% ~66%[ ,引,现已证实, Chinese Hepatology,June 2003,Vol 8,No.2 拉米夫定耐药性的产生主要与YMDD基序变异有关。拉米夫定耐药株的YMDD变异类型主要有两种,即 M550V/L526M 联合变异和M550I。本研究通过分析 YMDD基序变异,发现上海地区YMDD 的变异类型有3种,即M550V/L526M、M550I和M550I/L526M,以M550V/L526M 型变异最为多见,为46.67% ,依次为M550I(40%)和M550I/L526M(13.33%)。本研究还发现一种变异类型,即单独B 区的L526M 变异。本研究报告的3例单独L526M 变异与拉米夫定耐药有确定的关系,都在拉米夫定治疗1年后出现,都有 HBV DNA和ALT水平的反跳。由于临床上对拉米夫定耐药的多种检测方法主要针对YMDD基序,可造成对这种变异类型的漏检,因此拉米夫定耐药的检测应包括526位点。通过对S基因“a”决定簇分析,本组病例的血清型有adr和adw 两种,分别占56.94% 和43.06%。尽管在拉米夫定耐药株中adr亚型所占比例高于adw,但统计学上差异无显著性(P>0.05)。ZOllner等报道I6 J,与ayw相比,adw 亚型易发生拉米夫定耐药变异,约是前者的20倍。本研究为回顾性研究,不同亚型与拉米夫定耐药发生率之间有无关系,还有待用前瞻性研究加以明确。本研究结果提示,拉米夫定耐药变异可能不仅仅局限于YMDD基序,RT保守区的其他氨基酸变异也会引起HBV 对拉米夫定产生耐药性,并有可能对 HBV 的生物学特性产生影响。近来,国外学者对拉米夫定治疗后HBV RT非保守区变异的意义进行了研究。Bock等研究发现 J,3例慢性乙型肝炎患者发生 YMDD变异后出现病情恶化。序列分析显示,3例患者均有RT非保守区变异,并引起S基因“a”决定簇内变异。体外研究结果表明,这种联合变异可使病毒的复制能力明显增强,提示YMDD基序之外变异可补偿 HBV 的复制缺陷,可以解释临床上有些患者出现变异后HBV 的复制能力并未明显降低,病情反而出现恶化,甚至死亡。本研究有12例患者出现拉米夫定临床耐药,但未发现YMDD变异。拉米夫定耐药的原因可能与以上 YMDD基序之外变异有关。至于哪种变异是导致拉米夫定耐药的主要原因,目前尚不清楚。总之,拉米夫定耐药株的氨基酸变异不仅仅局限于RT B区的526和C区550两个位点,B、C区的其他位点、其他保守区以及RT非保守区也可发生多个变异。这些变异与拉米夫定耐药性及HBV 复制能力的关系有待进一步研究。
维普资讯 http://www.cqvip.com
参 考 文 献
1 Yeh CT ,Chien RN ,Chu CM ,et a1.Clearance of the original hepati. tis B virus YM DD-motif m utan ts with emergence of distinct lamivu. dine-resistan t mutan ts during prolonged lamivudine therapy.HepatologY, 2000,31:1318-1326. 2 Bock CT,Tillmann HL,Torresi J,et a1.Selection of hepatitis B virus polymerase mutants with enhanced replication by[amivudine treatment after liver transplantation.Gastroenterology,2002.122:264-273. 3 Lin X ,Yuan ZH , W u L,et a1. A sing le amino acid in the reverse · 31 · transcriptase domain of hepa titis B virus affects virus replication eficiency. J Virol,2001,75:11827.11833. 4 Lok A ,M cM ahon B. chronic hepatitis B. Hepa tology, 2001,34 : 1225.1241. 5 Benham ou Y ,Bochet M ,Thibault V ,et a1. Long -term incidence of hepatitis B virus resistance to lam ivudine in human immunodeficiency virus-infected pa tients. Hepa tology,1999,30:1302-1306. 6 Z611ner B,Petersen J,Schroter M ,et a1.20.fold increase in risk of lam ivudine resistan ce in hepatitis B virus subtype adw .Lancet,2001, 357:934—935 作者单位 上海复旦大学附属华山医院感染科 200040
本文是尹有宽版权所有,未经授权请勿转载。 本文仅供健康科普使用,不能做为诊断、治疗的依据,请谨慎参阅
发表于:2012-04-14