真性红细胞增多症(Polycythemia vera,PV),简称真红,是一种造血干细胞疾病,是以JAK2V617F突变或JAK2 12号外显子突变导致的红系增生为主伴有粒系和巨核系均增生为主要特征的慢性骨髓增殖性疾病,在2008年WHO的慢性骨髓增殖性肿瘤的分类中与原性性血小板增多症(Essential thrombocythemia,ET)和原发性骨髓纤维化(Primary myelofibrosis ,PMF)一起被归纳为Bcr/abl阴性的慢性骨髓增殖性疾病。临床以红细胞数及血容量显著增多,伴中性粒细胞及推动力小板升高为特征,出现多血质及高粘滞血症所致的一系列症状和体征,常伴有脾大和皮肤瘙痒,其起病隐匿,病程长,晚期可发生各种转化。早在1892年Vaquz就报道了一例以持续性血细胞增多并伴有发绀的病例。1904年Turk首先提出了PV早期即同时伴有粒及巨核细胞系增生。1951年Dameshek将PV、ET、PMF和慢性粒细胞白血症(Chronic Myeloid Leukemia ,CML)等疾病归类为一类相关性疾病并称之为慢性骨髓增殖性疾病。一、 发病的概况PV是一种少见的疾病,但并非罕见疾病,大多发生在中老年人,平均发病年龄在50-60岁,男性多于女性,各国均有发病,发病率较的国家和地区有以色列犹太人、日本长崎和瑞典哥德堡。以色列犹太人的发病率:男1.3/10万人,女0.5/10万人;日本长崎:男1.6/10万人,女0.4/10万人;瑞典哥德堡:1.4/10万人。我国于1957年首次有报告,文献报道的平均发病年龄为53岁,但由于缺乏该病的普查资料,我国暂无发病率的报道。二、 病因和发病机制虽然PV的病因至今不明,但众多的实验资料表明,PV患者具有以特点:1、发病的始动环节是发生在多能造血祖细胞水平,且转化型的造血祖细胞超过了非转化型的造血祖细胞而占主导地位;2、在无特定的刺激条件下,能过度产生一种或多种血细胞;3、在体外有自发性集落形成的能力;4、骨髓增生极度活跃,巨核细胞增生活跃或增生不良;5、主要的细胞遗传学改变累及到1、8、9、13和20号染色体;6、病人主要的死亡原因为出血及血栓形成;7、髓外造血旺盛;8、有自发性向急性白血病和骨髓纤维化转变的倾向。在2005年,国际上4个不同的研究组几乎在同一时期在不同的国际著名医学期刊报道了在PV患者中超过90%患者存在着JAK2V617F突变,这一“里程碑”式的发现对于阐明MPDS发病的分子机制,开拓了新的视野。JAK2是一种非受体胞浆酪氨酸激酶,通过转导来自各种细胞因子和生长因子受体的信号,在髓系发育中起重要作用。JAK2的结构模型提示V617至E621残基形成一个环,连结假激酶区域N端突起的两条β链,C618接触活化环。V617、C618和其它一些局部残基可抑制激酶活化环从非活化构象向活化构象移动(即,V617区域在负性调节JAK2信号传导时发挥直接作用)。大型的芳香氨基酸苯丙氨酸替代缬氨酸,很可能破坏这种负性调节,这也可以从分子基础上解释为什么PV患者的红系祖细胞在体外培养能自发性形成集落,以及骨髓增殖性疾病患者的红系祖细胞和髓系祖细胞对几种不同的生长因子特别敏感,但是对于JAK2V617F突变阴性患者的发病分子基础则有待于进一步研究。三、 病理PV病变主要累及骨髓、脾、肝。骨髓内红髓明显增多,而脂肪组织相对较少。骨髓结构仍基本正常,红系增生极为明显,粒及巨核系常同时增生,也可其中之一系增生,部分患者仅红系单独增生。幼红细胞在静脉窦旁呈岛状增生,各阶段粒细胞在小梁旁及血管周围弥漫性增生,巨核细胞在小梁间区增生。骨髓增生的细胞呈高度异型性,血窦扩张显著。骨髓储铁细胞及铁颗粒明显减少,约80%的患者铁染色阴性。病程后期,成纤维细胞及血管明显增生,同时出现大红细胞岛,伴不成熟粒细胞和异型巨核细胞。网状纤维染色示网状纤维高度增生,预示将转化或伴有骨髓纤维化。根据骨髓病理检查,将PV分为三期:红细胞增生期(此期骨髓造血功能活跃,红系细胞过度增生并伴有白细胞和血小板增多);稳定期(此期全血细胞维持在正常范围,这种变化并非由于病变的骨髓造血功能转变正常,而是骨髓被异常增生的纤维组织所替代,而骨髓造血功能较前减低的结果);骨髓衰竭期(此期骨髓纤维组织增生加剧,使髓内造血组织减少并产生髓外造血)。早期肿大的脾其脾窦显著扩张、充血,红系细胞增多,伴少量幼稚红细胞。晚期可出现三系造血细胞,类似髓样化生。肿大的肝脏其肝窦也扩张,同时伴有髓样化生。上述肝、脾在病理改变也是导致门静脉高压及频发上消化道出血的病理基础。如较大血管内有血栓形成时,相应脏器可见梗塞灶。其它器官通常无明显病理变化。四、 临床表现起病隐匿,通常在血常规检查时偶然发现,有的患者出现并发症如血栓形成或出血后才被确诊。1、神经症状 包括头痛、头晕、四肢胀痛和麻木、感觉障碍、视力下降、耳鸣OEMS综合症。严重时有意识障碍,甚至痴呆。上述症状和血粘度升高、血小板增多及腔隙性脑梗塞有关。2、多血症状 表现为结膜充血、面红、唇紫、舌暗红及血管怒张等。是由于红细胞过多、血粘滞度高、血流缓慢和组织缺氧,导致微循环及全身血管充血与扩张。3、出血 常见有牙龈出血、鼻出血,也可出现皮肤淤斑及胃肠道出血,少数患者并发脑出血。出血的原因大致有:血管过度扩张及血液淤滞导致血管内皮损伤、血小板功能异常、不适当使用非甾体镇痛药物导致血小板功能受损4、脾大 通常为轻至中度肿大,晚期伴有骨髓纤维化时脾大可达盆腔。5、血栓形成 为最常见的并发症,约在1/3的患者中发生,以脑血栓形成最常见,其次为心脏冠状动脉、下肢深静脉及脾受累少数可出现四肢动脉血栓形成。文献报道PV是肝静脉血栓形成(Budd-Chiar综合症)的重要原因之一,约占10%。血小板明显增多时,还可并发红斑性肢痛症,严重时发生肢端紫绀,甚至坏疽。6、皮肤瘙痒 国外报道皮肤瘙痒是PV的重要临床症状,皮肤痛痒发生率高达65.3%,作者观察了38例PV患者有14例出现皮肤瘙痒症状,且JAK2V617F突变阳性的PV与JAK2V61 7F突变阴性的PV之间无明显差异。皮肤瘙痒症状可以在PV诊断之前发生,也可以PV确诊以后发生。PV相关的皮肤瘙痒常被描述为在皮肤与水接触后出现的全身皮肤瘙痒、麻木、烧灼样或针刺样感觉,常被归为水性瘙痒(aquagenic pruritus,AP)除了皮肤与水接触后可以诱发瘙痒外,气温突然变化、烤火、锻炼后出汗、饮酒或使用热被褥均能诱发。其原因是由于肥大细胞在真皮层广浸润有关,也有作者认为PV相关的AP与缺铁和生物胺有关。有报道JAK2V617F突变阳性纯合子的PV患者皮肤瘙痒症发生率高达69%。7、其它 部分患者可并发Sweet综合症。PV患者由于骨髓细胞呈高代谢状态,核蛋白分解加速而致高尿酸血症,故临床痛风发作常见。五、实验室检查1、血常规外周血三系细胞增加,血色深而稠,血相对密度为1.075~1.080。红细胞≥6~10×109/L,血红蛋白≥180~240g/L,血细胞比容0.55~0.80,网织红细胞计数正常或稍高,可见红细胞大小不等,多染性及有核红细胞,晚期可见到异形红细胞及大量的泪滴形红细胞,提示并发骨髓纤维化。红细胞寿命早期正常,以后缩短,少数患者HbF可增高。2/3患者白细胞数增高,大多数为12~15×109/L,少数超过50×109/L,并有核左移及少数中、晚幼粒细胞出现。中性粒细胞NAP积分增高者占70%,粒细胞化学发光对某些拮抗剂如白细胞三烯的反应显示为选择性抑制异常。半数患者血小板计数在450~800×109/L,可见大型、巨型血小板,血小板对肾上腺素诱导的聚集反应异常,甚至缺如,血栓烷A2的产生和代谢分泌均增加,但对血小板活化因子刺激后的结合力减弱,血小板受体的表达减弱。2、骨髓象骨髓呈增生活跃或明显活跃,以红系增生为主,常同时伴有粒及巨核细胞系增生。各系的各期细胞比例正常。铁染色示细胞内、外铁均减少,甚至消失。骨髓活检显示前述病理改变,有助于诊断。3、红细胞容量用核素51Cr标记法测定红细胞容量,PV患者均明显升高。该项检查是确诊红细胞增多的重要指标,重复性高。并发门静脉高压时,因血浆容量增加,可造成RBC、Hb及HCT正常的假象,缺铁时也可发生类似现象。此时检查红细胞容量则可确诊。4、染色体骨髓染色体核型分析约25~35%患者有各种获得性异常,其中以8号、9号染色体三体最常见,其它有20q-、11q-及13q-。经化疗、放疗,或病情进展后可出现5q-、7q-等异常。诊断时即有细胞遗传学异常者,预后差。5、分子生物学几乎所有PV患者骨髓幼红细胞内抗凋亡因子如Bcl-XL(B-cell leukemia-XL)表达增高,STAT3或STAT5过度活化。近几年研究表明,95%以PV患者存在着JAK2V617F突变。6、其它血流变学检查,显示血粘度明显升高,血沉减慢。各项凝血及纤溶指标大多正常,但有报告抗凝血酶、蛋白C、蛋白S降低,及存在蛋白C抵抗,提示抗凝活性下降。约40%患者由于从粒细胞中释放增多,血清维生素B12显著升高。叶酸及铁蛋白常减少。血尿酸、LDH升高。血气分析示血氧饱和度正常。血清EPO水平降低。体外骨髓干细胞培养,BFU-E生长常无需EPO存在。超声心动图检查显示77%的PV患者有主动脉瓣或二尖瓣病变如瓣膜变厚、赘生物,此为血栓栓塞性并发症的病理基础之一。六、 诊断2002WHO诊断标准:A标准:1、红细胞数目较正常平均值增高25%,或男性血红蛋白>18.5g/L,或女性>16.5g/L 。 2、无继发性红细胞增多的原因,包括: ⅰ、缺氧(动脉动氧分压≤92%; ⅱ、高氧结合力的血红蛋白; ⅲ、截短的促红细胞生成素受体; ⅳ、由于肿瘤所产生的过量的促红细胞生成素。 3、脾脏肿大 4、在骨髓细胞中除外Ph染色体或BCR-ABL融合基因以外的克隆性遗传学异常 5、内源性红系集落形成B标准:1、 血小板>400×109/L2、 白细胞>12×109/L3、 骨髓活检示全骨髓增生活跃,以红系和巨核系增生更为显著4、 血清促红细胞生成素浓度低 符合上述A标准的第1、2条,或者A标准的其它任何一条加上2个B标准即可以诊断。国内诊断标准:⑴临床:A、多血质表现;B、脾肿大;C、高血压,或病程中有过血栓形成。⑵实验室:A、血红蛋白≥180g/L(男)或≥170g/L(女),红细胞数≥6.5 ×1012/L(男)或≥6×1012/L(女);B、红细胞容量>39ml/kg(男)或>27ml/kg(女);C、血细胞比容≥0.54(男)或≥0.5(女);D、无感染及其它原因白细胞多次>11×109/L;E、血小板多次>300×109/L;F、外周血中性粒细胞碱性磷酸酶染色积分>100;G、骨髓增生明显活跃或增生活跃,粒、红、巨核细胞三系均增生,尤以红系为。⑶能除外继发性或相对性红细胞增多症。具有上述⑴类任何2项,加⑵类中A、B二项,再加⑶类可诊断为PV。如无检查红细胞容量条件时,⑵类中A及有C至G中任何4项,再加⑶类也可诊断。近年来由于JAK2V617F突变的发现,目前国外出现了分子诊断标准,首先作Bcr/abl检测确认为Ph阴性的慢性骨髓增殖性疾病,然后作JAK2V617F检测将PV分为JAK2V617F突变阳性和JAK2V617F突变阴性二大类,其诊断标准如下:JAK2阳性的真性红细胞增多症(需要以下二条)A1:红细胞压积增高(男性>52%,女性>48%),或者红细胞计数增加(>正常25%);A2:有JAK2突变;JAK2阴性真性红细胞增多症(符合A1、A2、A3或者任何一个A标准加上二个B标准可以认断)A1:红细胞增加(大于正常25%)或者红细胞压积在男性≥60%,女性>56%;A2:无JAK2突变依据;A3:无继发性红细胞增多的因素(动脉氧饱和度正常,血清Epo在正常水平);A4:可触及的脾脏肿大;A5:在造血细胞上有获得性细胞遗传学的异常(除外BCR-ABL);B1: 血小板增多(>450×109/L);B2:中性粒细胞增多(中性粒细胞>10×109/L,在吸烟者>12.5×109/L);B3: 在放学线上有脾脏肿大;B4:有内源性红系集落形成或者血清Epo浓度较低。七、 鉴别诊断PV必须和继发性及相对性红细胞增多症鉴别。继发性红细胞增多症是由于长期慢性缺氧致EPO升高,刺激骨髓红系过度反应所致。常见于右至左分流的先天性心脏病、慢性阻塞性肺病、氧亲合国过高或携氧能力减低的异常血红蛋白病。此外,肾积水、肾囊肿、肾肿瘤因压迫肾组织,使局部血流减少而刺激EPO产生过多,致红细胞生成增多。相对性红细胞增多症又称良性或假性红细胞增多症,是由于血浆容量减少所引起,并非真正的红细胞增多。部分患者红细胞增多为暂时性,如持续呕吐、严重腹泻、大量出汗、大面积烧伤等造成脱水或组织液减少。此时外周红细胞呈一过性增多,后随原发病控制而很快恢复正常,另有少数患者和吸烟、焦虑、肥胖等有,去 除诱因右恢复正常。但其中少数患者也可并发血栓性并发症,少数可发展为PV。八、 治疗除了异基因造血干细胞移植的零星报道,目前尚无治疗可根除异常克隆。因此PV的治疗目的包括:抑制骨髓红系细胞异常丧生、降低血容量、减少血粘度、消除红细胞增多所致的各种症状和体征、减少血栓栓塞及出血性并发症、提高生活质量并延长生存期。低危血栓形成患者(小于60岁、无血栓病史)可能不需要额外治疗。对高危血栓(超过60岁或有血栓史)或对静脉放血要求很高的患者,根据年龄给予骨髓抑制性治疗,70岁以上的年老患者可给予32P或白消安;年轻患者可以选择羟基脲。(一)静脉放血使血细胞比容保持在安全水平(小于0.45)为基本的、安全有效的治疗方法,可以减少血栓形成和出血的危险性。一般每次放血300~500ml,间隔1~3日,至乱转细胞比容达到正常范围。老年人及有心血管疾患者,每次放血200~300ml。此法简便、安全,能缓解与血容量及高粘滞度有关的症状,但不能改善肝脾肿大、皮肤瘙痒及痛风的症状,不能控制白细胞和血小板数量,仍可形成血栓,反复放血可引起缺铁,但禁用铁剂。为防止放血后血栓形成,放血后可静脉输注低分子右旋糖酐500ml。由于PV患者血液粘稠,应用传统的采血袋放血常难以达到放血治疗的要求,近年来,由于全自动血细胞分离机在临床上广泛应用,应用血细胞分离机对PV患者进行治疗性红细胞分离单采术,可快速、有选择性、有效地减少患者血循环中病理细胞含量,迅速缓解高粘滞血症。单采1~2次右获明显效果,不良反应为大量抗凝剂进入体可造成低乱转症。(二)放射性核素32P32P为放射性核素,能释放β射线进行选择性内照射,抑制核分裂,达到抑制骨髓造血的目的。由于异常克隆细胞的代谢旺盛,对射线敏感,摄取32P较正常细胞多。适用于症状明显、羟基脲治疗无效者,不愿意定期服药者,发病年龄在70以或有出血和血栓形成者,放血后可用32P巩固。如白细胞和血小板数正常,而症状明显时,应慎用。白细胞及血小板数低于正常、严重肝肾疾病、脑出血急性期、活动性肺结核、妊娠及哺乳期均为禁忌。常用的是磷酸氢二钠,可溶于水,口服,静脉注射效果更好。其半衰期14.3min,用药30~60min后红细胞开始下降,可缓解几个月至3年。具体用法为74~148MGq/m2体表面积,静脉注射,总是不超过185MBq,如在3个月内不见效,可再给第二次剂量(37~148)MBq,一般病例不需要第二次用药。用药后先有自觉症状好转,1个月左右出现白细胞和血小板减少,红细胞和血红蛋白常于2~3个月才下降,脾脏于用药后1~3个月开始缩小。32P治疗的中位生存期为10~14.5年,PVSG报道静脉放血、32P与苯丁酸氮芥治疗PV后白血病发生率分别为7%、16%和20%。大部分病例在用32P后2~8年内发生。(二)化学治疗适用于⑴血小板计数高于800~1000×109/L;⑵脾脏显著肿大,并有脾梗死;⑶严重皮肤瘙痒;⑷老年人及有心肺疾病不宜放血治疗;⑸需大量放血才能控制病者。国外曾用苯丁酸氮芥、环磷酰胺与左旋苯丙氨酸氮芥(马法兰)等治疗,近年来用溴丙哌嗪及羟基脲治疗;国内用二溴甘露醇和高三尖杉酯碱等治疗也有一定效果。⑴羟基脲 是一种骨髓抵制剂,它是通过抑制胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入DNA从而抑制DNA合成。其骨髓抑制时间短,停药后数天后白细胞就能回升,与放血联合治疗时,血栓并发症降低。用法:15~20mg/kg.d,或1.0~2.0g,每日2次,但需要每周查血常规,根据红细胞、血红蛋白及白细胞数增减,用药后血常规示红细胞、白细胞下降,脾脏缩小,但需用小剂量(0.5~1.0g/d)维持。目前已文献报道应用羟基脲可明显减少JAK2V617F突变等位基因的负荷量,其促白血病作用较其他烷化剂低。⑵白消安 能抑制DNA合成,阻碍细胞分裂,抑制骨髓造血。2~6mg/d,分次口服,自开始治疗1~2个月,大多数病例临床症状消失,肝脾缩小,血常规恢复正常,全血容量和红细胞容量下降,可缓解1年左右。此药对白细胞与血小板增多者,特别是血小板明显增多者更好。但用药量过大可引起严重骨髓抑制,长期白细胞与血小板减少,此外可有皮肤色素沉着等不良反应。⑶苯丁酸氮芥 4~6mg/d,分次口服,大部分病例有效,不良反应少,仅个别病例有寻麻疹与秃发。由于其致白血病的发生率高,故目前已不用。⑷环磷酰胺和马法兰 属烷化剂,用药后中位缓解可达5~6个月,因与苯丁酸氮芥一样有致白血病作用,现已少用。⑸溴丙哌嗪 为哌嗪类药物,国外已用于治疗本病,75mg/d,分3次口服,用药2~3个月有90~95%病例可获完全缓解,以后要维持治疗,25mg/d。主要不良反应为胃肠道反应,但也有使白细胞和血小板减少等。其诱发白血病风险相对较高,治疗5年、7年和14年的风险分别为6%、9%和27%。⑹高三杉酯碱 属细胞非特异性抗肿瘤药物,抑制肿瘤细胞的DNA与蛋白质合成。一般2~4mg加入500ml液体中每日静脉滴注,10~14天为1疗程。高三杉酯碱治疗虽有效但易复发,重复使用仍有效,不良反应有心肌损害、胃肠道反应、白细胞和血小板减少等。(三)靶向治疗⑴干扰素 1988年R.Silver首先应用干扰素来治疗PV,能抑制过度增生的红细胞和血小板,改善皮肤瘙痒和脾脏肿大症状。2008年M.D.Anderson研究小组报道了聚乙二醇干扰素α2a可使14%JAK2V617F突变阳性的等位基因转阴。用法300万U~600万U皮下注射,每周3次。⑵JAK2V617F抑制剂 目前国外正在进行JAK2V617F抑制的临床试验,其中二个在Ⅰ、Ⅱ期临床试验中明显有效的药物有INCB018424和CEP701,INCB018424可使94%的PV患者达到缓解和部分缓解,对于羟基脲治疗无效的PV患者的疗效目前正在临床试验中。(四)其它治疗低剂量的阿斯匹林(50mg/d)可使血栓素A2的产生80%以上,故推荐长期使用,尤其是适用于单独静脉放血治疗,以减少血栓栓塞并发症。文献报道各种抗组胺药物对PV相关的皮肤瘙痒治疗有效率为66.6%,西米替丁治疗有效率为44%,干扰素治疗有效率为80%。PV晚期合并骨髓纤维化(有人称贷之为PV的衰竭期),患者常有巨脾、贫血、白细胞、血小板减少,处理十分困难。脾区放疗已证实无效。脾切除至少可取得暂时的缓解。由于手术并发症多,死亡率高达25%,应谨慎进行,并充分作好术前准备。重度贫血者常需定期输血,也可使用雄激素。缺铁时补充铁剂因可在短期内迅速增加红细胞而加重病情,故应慎重补铁。PV患者因并发外科疾病的手术包括拔牙,术后并发症高达47%,其中大多数为出血或血栓并发症,故主张术前先行放血及血细胞置换,待血象好转后再手术。九、 病程及预后本病发展缓慢,未经治疗者的中位生存期为1.5年,但经各种治疗后,中位生存期可达10~15年。病程长短与许多因素有关,如治疗方法、发病时的年龄、及有无并发症有关。不同的治疗方法其病程不同,苯丁酸氮芥治疗的中位生存期为8.9年,32P治疗者为11.8年,静脉放血治疗者为13.9年。发病年龄中,中年组较老年组病程长。白细胞与血小板数高者预后差。死亡原因以血栓为最多30~40%,其中心肌梗死占50%、脑卒中占31.5%、静脉血栓占18.5%。其它依次为急性白血病(19%)、肿瘤(5%)、出血(5%)。余下的病例死于晚期骨髓衰竭(包括骨髓纤维化),其中大多数因中性粒细胞缺乏,死于感染,另为血小板减少,死于内脏出血。参考文献[1] James W.Vardimam,Nancy Lee Harris,and Richard D.Brunning. 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(附1例病历报告)沈婵娟 袁朝晖 陈慧娟 胡国瑜* ( 株洲市一医院血液科 湖南株洲 412000) 恶性淋巴瘤常由于输尿管梗阻或肾实质浸润而导致肾功能衰竭。但是以急性肾功能为首发表现的淋巴瘤文献报道并不多。对该疾病的治疗目前来看并没有一个安全成熟的方案。我们最近美罗华联合化疗成功的抢救了一例以急性肾功能衰竭为首发表现的B细胞性淋巴瘤,并结合文献复习报道如下:1.病例摘要患者男,64岁。因全身浮肿1周,腹胀5天,尿量减少3天于2008年9月4日入住我院肾内科。体查:T36.0℃,P74次/分,R20次/分,BP150/92mmHg,发育正常,营养中等,全身中度凹陷性浮肿,双侧耳后分别可扪及大小约2×1cm,1×1cm肿大淋巴结,质韧,无压痛,与周围无明显粘连,双肺呼吸音清,未闻及罗音,心率74次/分,律齐,无杂音,腹稍膨隆,无压痛,反跳痛,肝脾肋下未及,移动性浊音可疑阳性,双下肢中度凹陷性浮肿,双侧巴氏症(—)。入院时肾功能示血尿素氮6.4mmol/L,肌酐83μmol/L,尿酸334μmol/L,尿量约500ml/天,肝功能示ALT 11IU/L,AST 20IU/L ,ALB 22.84 g/l,尿常规示BLD(2+),PRO(3+),24小时尿蛋白定量0.6/l,血常规示WBC 17.52*109/l,PT 72*109/l,Hb 92g/l,肾内科住院期间监测患者肾功能,尿素氮、肌酐进行性上升,9月8日肾功能示血尿素氮19.47mmol/L,肌酐449μmol/L,尿酸369μmol/L,无尿,开始行血液透析,隔天1次,9月10日患者出现咽痛,咳嗽,痰中带血,体查发现双侧扁桃体Ⅱ度肿大,右侧扁桃体窝处可见一肿物,表面破溃,行扁桃体活检提示B细胞性非何杰金淋巴瘤,免疫组化如下:CD20(+),CD45RO(+),CD56(-),TIA-1(-),CD79(++),CD3(-)。9月19日肾功能示血尿素氮9.2mmol/L,肌酐760μmol/L,尿酸224μmol/L,考虑患者肾功能进行性恶化是淋巴瘤相关性的,于9月22日转入血液科。转科后完善纵隔、腹部CT检查未发现肿大淋巴结,骨髓检查示正常骨髓像。于9月23日开始行R-COP(具体用量:美罗华670mg(375mg/m2)d1,环磷酰胺 0.4 d1,3,5,长春瑞滨 45mg d1,强的松 90mg d1-7)方案化疗,化疗过程中在环磷酰胺间歇期辅以血液透析治疗,加强营养支持及维持水电解质平衡,化疗第7天,患者尿量增多为1030ml,复查肾功能尿素氮,肌酐进行性下降。于10月20日复查肾功能血尿素氮10.95通信作者:胡国瑜,男,博士,血液内科副主任医师 Email:doctorhgy@163.commmol/L,肌酐222μmol/L,尿酸296μmol/L,尿量已恢复正常,予以第二程化疗,方案R-CHOP(具体用量:美罗华670mg d1,CTX 0.4 d2,4,6,NVB 45mg d1,强的松 60mg d1-7,表阿霉素 120 mg d2 ),化疗过程顺利,于11月4日出院。患者此次出院后,一般情况可,按期返院行化疗,予以2程R-CHOP及2程CHOP,肾功能完全正常,获得完全缓解。2.讨论:2.1 恶性淋巴瘤引起急性肾功能衰竭的机制淋巴细胞增值性疾病中肾脏受累是很常见的,最常见的原因就是腹膜后腹主动脉旁淋巴结压迫双侧输尿管,此外就是NHL浸润肾实质引起肾功能不全。尽管尸检显示42%-57%的NHL患者有肾脏受累,但临床肾脏疾病的报道率只有0.5%-7.3%。 [1]。关于淋巴瘤相关性急性肾功能衰竭的机制有如下一些报道:自发性肿瘤溶解综合症引起的严重的高尿酸血症从而导致肾功能衰竭[2],淋巴瘤在发展过程中浸润肾脏,或者原发于肾实质的淋巴瘤引起肾功能恶化[3],高钙血症引起的肾钙沉着症导致的肾功能衰竭[4],淋巴瘤相关性嗜血细胞综合症的高细胞因子血症引起肾小管坏死样病变从而导致肾功能衰竭,此外血管内淋巴瘤引起急性肾前性肾衰[5]。该患者我们行了腹部CT检查未发现腹腔肿大淋巴结,排除了排除了腹腔肿大淋巴结压迫双侧输尿管造成的梗阻性肾病,该患者血尿酸正常排除了尿酸性肾病,此外该患者无出血,失水表现不考虑血容量不足引起的急性肾前性肾衰,患者骨髓细胞学检查未发现嗜血组织细胞,不支持嗜血细胞综合症相关的肾损害,患者肾功能恶化,考虑淋巴瘤浸润肾实质可能性大,但需行肾脏活检以进一步明确。2.2 美罗华在以急性肾功能衰竭为首发表现的B细胞性恶性淋巴瘤的治疗对伴急性肾功能衰竭的淋巴瘤病人并无标准的治疗方案,因为报道的病例比较少。最常见的治疗方案是环磷酰胺,长春新碱,阿霉素,泼尼淞(CHOP)[6,7] ,各种其他的化疗药物也有所尝试[7,8]。2000年美罗华获得中国食品药品监督管理局批准用于我国临床,用于难治复发的CD20阳性的B细胞性非何杰金淋巴瘤,但美罗华在急性肾功能衰竭的病人中经验尚有限。美罗华是一种嵌合鼠/人的单克隆抗体,该抗体与正常或恶性B细胞淋巴瘤表面的CD20特异性的结合,并引发B细胞溶解的免疫反应。细胞溶解的可能机制包括补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC),并可诱导细胞凋亡[9]。此外,体外实验证明,利妥昔单抗可使药物抵抗性的人体淋巴细胞对一些化疗药的细胞毒性敏感。放射性核素造影显示大约7%-28%的利妥西单抗单抗通过尿路排泄,大部分的药代动力学实验集中在研究美罗华血浆浓度和临床疗效之间的关系,肾脏在药物清除方面的作用尚不是很清楚[10]。Anand P. Jillella,等的研究显示血液透析后美罗华的血浆浓度较透析前高,且在透析液标本中没有发现美罗华,证实美罗华不被血液透析所清除[11]。美罗华在急性肾功能衰竭的病人的应用,经验是有限的,通过文献复习,我们找到了其他5例应用美罗华的并有急性肾功能衰竭的淋巴瘤病人[3,12,13,14] ,其中4例病人行了血液透析[3,12, 14],其中1例病人美罗华是375mg/m2,分次给药,100mg/天[12],其余的都是一次足量375mg/m2,这5位病人都未出现美罗华输注相关副作用,其中3例病人获得完全缓解,肾功能恢复[3,12,13],1例病人部分缓解,4个月后死于败血症[12],还有1例疾病没有进展,肾功能没有恶化[14]。我们这个病人,化疗前一周3次血透,但肾功能进行恶化,少尿甚至无尿,淋巴瘤诊断明确后,与R-COP方案化疗一程,化疗期间行3次血液透析,化疗第7天患者尿量增多,肾功能好转,已无需再行血液透析治疗,此后该病人行了3程R-CHOP及2程CHOP方案。在第2程化疗结束后患者临床症状缓解,肾功能基本恢复正常。随访该病人至今,患者一般情况好,完全缓解。综合以上病例,美罗华在急性肾衰病人中的应用是安全的。参考文献:1. Geffen DB, Fisher RI, Longo DL, et al. Renal involvement in diffuse aggressive lymphomas:results of treatment with combination chemotherapy[J]. Journal of Clinical Oncology, 1985 May;3(5):646-532. Karagiannis A, Tsorlalis I, Kakafika A, et al. Acute renal failure due to tumor lysis syndrome in a patient with non-Hodgkin's lymphoma[R]. Ann Hematol. 2005 May;84(5):343-6.3. Diskin CJ, Stokes TJ, Dansby LM, et al. 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胡国瑜1 张玲2 袁朝晖2 罗丹2(1. 中南大学湘雅二医院血液科博士研究生,现在株洲市一医院血液工作,2.株洲市一医院血液科,412000)[摘要] [目的] 探索JAK2V617F突变在在真性红细胞增多症的诊断与鉴别临床应用价值,并筛选一种适合于临床实验室常规开展的检测JAK2V617F突变的实验方法。[方法] 对38例确诊为真性红细胞增多症患者、20例继发性红细胞增多症的患者和20例正常健康对照者的外周血中性粒细胞基因组DNA进行提取,并应用等位基因PCR技术和PCR产物直接序列测定对JAK2基因第14号外显子第1849位核苷酸是否存在G→T突变,以确定JAK2V617F突变对诊断真性红细胞增多症的特异性,同时比较二种检测方法的敏感性和特异性。[结果] 应用PCR产物序列测定的方法在38例真性红细胞增多症有32例(占84%),在20例继发性红细胞增多症和20例正常健康对照组中均发现一例突变,而用等位基因特异性PCR技术在在38例真性红细胞增多症检测到35例(占92%)存在JAK2V617F突变,并经过PCR产物正反序列测定得到证实,在20例继发性红细胞增多症和20例正常健康对照组中均发现一例突变。[结论] JAK2V617F突变的检测可作为诊断为真性红细胞增多症的特异性分子标志物,而等位基因特异性PCR技术在检测JAK2V617F突变中较PCR产物序列测定具有更高的敏感性和特异性,更适合于临床实验室常规开展。[关键词] 真性红细胞增多症,慢性骨髓增殖性疾病,JAK2V617F突变The clinic study of JAK2V617F mutation detection in diagnosis of polycythemia veraHu Guo-yu1,Zhang Ning2,Yuang Chao-hui2,Luo Dan2(1. Department of Hematology,The Second Xiaya hospital,2. Department of Hematology ,The First hospital of ZhuZhou city)[Object] To investigate the diagnostic value of JAK2V617F mutation in diagnosis and differential diagnosis of polycythemia vera,and screen a more simple method for clinic laboratory to detecte the mutation of JAK2V617F.[Method] DNA was extracted by standard procedures after isolating total leukocytes from peripheral blood mononuclear cells by density gradient centrifugation over Histopaque 1077.DNA samples were amplified. Single-stranded biotinylated PCR products were prepared for sequencing . At the same time ,in order to testify the realiability of the allele-specific PCR,we also applied the allele-specific PCR using two forward primer and one common reverse primers for identifying the mutation.[Result] In 32of 38 patients with polycythemia vera, JAK2V617F mutation was determined by conventional DNA sequencing------.But the allele-specific PCR detected 35 patients occurs JAK2V617F mutation.And these were testified by DNA sequencing.None mutation was found in secondary polycythemia and normal control.[ Conclusion]: A-gain -of-function mutation of JAK2V617F occurs in nearly all patients with PV,and JAK2V617F mutation should be a molecular marker in diagnosis of polycythemia vera..Allele-specific PCR is a very sensitive and specific method for detecting JAK2V617F mutation.早在1892年Vaquz就报道了一例以持续性血细胞增多并伴有发绀的病例, 但直到1974年Prchal在实验中发现[1]:真性红细胞增多症(PV)患者骨髓的红系祖细胞在体外能在缺乏促红细胞生成素﹙EPO﹚的条件下生长,这与随后的几个实验均证明PV是一种造干血细胞克隆性疾病[2]。对诊断PV尽管有严格的诊断标准[3],但是由于对其分子发病机制不了解,因此对红细胞增多症的诊断与鉴别诊断缺乏像bcr/abl在诊断慢性粒细胞白血病一样的特异性分子标志物。在2005年,国际上4个不同的研究组[4-7]几乎在同一时期在不同的国际著名医学期刊报道了在绝大数真性红细胞增多症﹙PV﹚患者存在着JAK2基因14号外显子1894位核苷酸G→T的突变(JAK2V617F突变),这为PV的诊断提供了一个特异性分子标志物,为观察JAK2V617F突变的检测在诊断PV的临床应用价值,并为临床实验室筛选出一种更加简便可靠的JAK2V617F突变的检测方法,我们应用等位基因PCR技术和PCR产物直接序列测定对38例确诊为真性红细胞增多症患者、20例继发性红细胞增多症的患者和20例正常健康对照组的外周血中性粒细胞JAK2V617F突变进行了检测,现报道如下:1 资料与方法一般资料 38例真性红细胞增多症的诊断标准均按WHO拟定的诊断标准[1],平均年龄61岁,其中男性18例,女性20例; 20例继发性红细胞增多症其中男性13例平均年龄64岁,其中男性13例,女性7例;20例正常健康对照者平均年龄30岁,其中男性6例,女性14例。方法标本采集 所有患者及正常对照组均常规采外周静脉肝素抗凝血10ml,并用中性粒细胞分离液分离出中性粒细胞,用酚氯抽提法提取外周血中性粒细胞基因组DNA,用TE保存在在-20℃冰箱中备用。1.2.2测序PCR PCR直接序列测定的前向引物为5′-TCCTCAGAACG TTGA TGGC AG-3′,反向引物为5′-ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGAT-3′,测序PCR的反应体系组成:80ng基因组DNA、MgCl2 1.25mM、dNTP 0.2mM、Taq酶2U、前向引物和反向引物的浓度均为15Pmol,总体积50ul。将上述成份依次加入到PCR反应管中,轻轻混匀后短暂离心,离心速度为3000rpm/min,离心30sec,然后置于自动PCR仪内扩增,反应条件如下:预变性94℃,7min;然后进入热循环,条件为94℃变性,30 Sec; 56℃退火30Sec,72℃延伸1 min,为充分让基因组DNA被扩增,在第一个循环时,72℃延伸7min ,共36个循环,循环结束后取5ulPCR产物作1.5%琼脂糖凝胶电泳,如在453bp处有明显的产物条带将PCR产物送测公司行PCR产物序列测定。1.2.3等位基因特异性PCR用一个共同的下游引物,二个上游引物,其中一个引物包含有突变位点(只扩增有突变的基因序列,即在3端的第三个核苷酸含有一个故意错配的碱基)以提高特异性(扩增的产物大小为203bps),另一个上游引物可从突变型及野生型等位基因中扩增,其产物大小为364bps,作为PCR内参照,其具体序列如下:内参照前向引物:5-ATCTATAGTCATGCTGAAA GTA GGA GA AAG-3,特异性前向引物:5-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3,共同的反向引物:5-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3,其反应体系组成同测序PCR,引物浓度为两个前向引物均为7.5Pmol,共同的反向引物为15Pmol。PCR反应条件:预变性94℃,7min;然后进入热循环,条件为94℃变性,30 Sec;58℃退火30Sec,72℃延伸1 min,为充分让基因组DNA被扩增,在第一个循环时,72℃延伸保持7min ,共36个循环,循环结束后取PCR产物5ul行1.5%琼脂糖凝胶电泳,如在364bps和203bps处均有明显的产物带者为JAK2V617F突变阳性,如只在364bps处有一个单一产物带者为JAKV617F突变阴性。1.2.4 统计学处理 数据均以均数±标准差(x±s)表示,并在2 结果我们应用PCR产物序列分析,对38例真性红细胞增多症患者、20例继发性红细胞增多症患者及20例正常对照者的JAK2基因进行体PCR扩增,并对其扩增产物进行碱基序列测定,一次性PCR产物序列测定结果发现38例真性红细胞增多症有32例存在JAK2V617F突变,突变率为84%,而在20例继发性红细胞增多症和20例正常对照者中未发现一例存在JAK2V617F突变。同时我们应用等位基因特异性PCR技术,对上述标本进行了JAK2V617F突变的检测,结果发现,38例真性红细胞增多症患者共检测出35例(占92%)患者存在JAK2V617F突变(,而对于20例继发性红细胞增多症和20例正常对照者的检测中均未发现一例突变,这说明JAK2V617F突变在真性红细胞增多症的诊断中具有高度的特异性。为了确定等位基因特异性PCR技术在检测JAK2V617F突变的可靠性,我们对常规一次性PCR产物序列测定未检测出有JAK2V617F突变而等位基因特异性PCR技术检测存在JAK2V617F突变的三例真性红细胞增多症患者的JAK2第14号外显子的PCR扩增产物进行反复的5/→3/和3/→5/序列测定,结果证实这三例患者确实存在JAK2V617F突变,这说明等位基因特异性PCR技术在检测JAK2V617F突变中具有较高的特异性和敏感性。泳道1、4、5、7、10为真性红细胞增多症,泳道2、3、6为继发性红细胞增多症,泳道8、9为正常对照,在364bps和203bps处均有明显的产物带者为JAK2V617F突变阳性,如只在364bps处有一个单一产物带者为JAKV617F突变阴性3、讨论早在1892年Vaquz就报道了一例以持续性血细胞增多并伴有发绀的病例,但有关该病的分子发病机制不明确,因而导致对该疾病的诊断缺乏像bcr/abl对慢性粒细胞白血病的诊断一样的分子标志物。1974年,Prchal JF[1]发现PV患者的红系祖细胞在体外培养能自发性形成集落,随后,研究者们又发现这些患者的红系祖细胞和髓系祖细胞对几种不同的生长因子特别敏感[8-9],这些实验研究结果提示,PV发病的始动因子可能存在于多种生长因子受体下游的信号途径之中。JAK2是一种非受体酪氨酸激酶,在多种造血生长因子受体信号传导中起关键性作用,因此,JAK2基因是研究CMPDs分子发病机制特别受关注的基因[10-11]。大量的研究资料证实,JAK2是一种非受体胞浆酪氨酸激酶,通过转导来自各种细胞因子和生长因子受体的信号,包括白介素-3(IL-3)、白介素-5(IL-5)、促红细胞生成素(EPO)、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和促血小板生成素(TPO),在髓系发育中起重要作用。因此,JAK2基因是研究CMPD发病分子机理的理想靶基因。我们运用PCR产物序列测定对38例PV患JAK2第14号外显子进行PCR扩增及DNA测序结果显示,32例PV患者中(84%)存在JAK2V617F的突变,而在20例继发性红细胞增多症及正常对照者中未发现一例突变,且我们检测的结果与国外其它几个研究小组的结果相一致[4-7],这说明JAK2V617F突变是PV患者的分子发病机制。对于任何一种恶性疾病中多数细胞中存在突变的解释目前只有二种:突变可能导致异常克隆的生长及生存优势;或者可能表明在同一细胞存在偶发的“一过性”突变。后一种解释不可能作为JAK2V617F突变的解释理由,因为绝大多数PV患者存在同样的突变。JAK2V617F突变之所以是PV的发病机制之一,因为这种突变发生在假激酶(JH2)区域的高度保守区,该区域与真正的酪氨酸激酶区域是同源的,但缺乏关键的催化基团。JAK2的结构模型提示V617至E621残基形成一个环,连结假激酶区域N端突起的两条β链,C618接触活化环。V617、C618和其它一些局部残基可抑制激酶活化环从非活化构象向活化构象移动(即,V617 区域在负性调节JAK2信号传导时发挥直接作用)[12]。大型的芳香氨基酸苯丙氨酸替代缬氨酸,很可能破坏这种负性调节,这也可以从分子基础上解释为什么PV患者的红系祖细胞在体外培养能自发性形成自发集落[1],且对几种不同的生长因子特别敏感[8、13-14],但是对于JAK2V617F突变阴性患者的发病分子基础则有待于进一步研究。文献报道,一次性PCR产物的核苷酸序列分析并不能检测到所有的V617F突变,即PCR产物测序可有假阴性结果。有报道只有在超过40%的细胞存在杂合子突变时方可通过基因测序重复检测到突变,而应用敏感的等位基因特异性PCR测定技术,当3%的细胞存在杂合子突变时即可检测到[15]。我们的结果显示,应用敏感的特异性等位基因PCR方法的确能够提高JAK2V617F突变的阳性检测率,为证实这一现象,我们通过反复PCR产物正么序列测定证实了该方法对突变检测的可靠性。有关CMPDs的诊断通常是复杂的,如果要作PRV-1或中性粒细胞的抗原NBI/CD177的表达则更加复杂,且费用昂贵。由于JAK2V617F突变仅发现在PV患者中,而存在于继发性红细胞增多症及正常对照中,因此检测JAK2V617F突变对诊断PV有重要的临床意义。我们的实验证明用等位基因特异性PCR方法来检测JAK2V617F突变是一种简单、费用低、特异性高的方法,可提高对PV 患者JAK2V617F突变的阳性检出率,可以作为临床PV分子诊断的常规检查手段。参考文献[1] Prchal JF,Axelrad AA. 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