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靶向高通量测序在感染性疾病中的应用现在临床上用的宏基因二代测序检查，即高通量测序检查项目，在三甲医院普遍被应用，价格昂贵，而且属于自费项目。我们来进一步认识一下这项高通量测序检查项目的详细分类和最新检测技术进展。感染性疾病是全球致残和致死的主要疾病之一，对于感染性疾病致病性微生物的检测一直是临床上的重点。传统的病原体检测技术面临培养阳性率低、时间长、难以检出苛养菌等局限性、近年来，高通量测序（high-throughputsequencing,HTS）的快速发展给病原体的检测带来新的突破，HTS在临床实验室中最常见的应用包括宏基因组高通量测序（metagenomicshigh-throughputsequencing,mHTS)、全基因组测序（wholegenmoesequencing,WGS)、靶向高通量测序（targetedhigh-throughputsequencing,tHTS）等。目前，mHTS应用最为广泛。mHTS测序深度大、覆盖面广、测序效率高，可以在一次测序过程中测出样本中所有的核酸序列，在检测出病原微生物的同时对病原体进行种属鉴定。相较于传统的病原学检测，mHTS的优势如下：①更高的灵敏度和准确性，弥补了传统病原学检测方法的不足：②更快的检测速度，可以早期提供临床信息；③更广的检测范围，可以同时检出临床标本中的细菌、真菌、病毒、非典型病原体和寄生虫，在检测罕见、新发病原体方面更具有优势：④检测结果受抗菌药物经验治疗的影响小。mHTS的局限性如下：①检测结果易受人源序列的影响：②同时只能进行单一的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）或核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）测序；③价格昂贵等；④结果解读困难；等等。mHTS仍在不断地创新和发展，tHTS的出现从技术原理上弥补了HTS在病原学诊断中的部分不足。一、靶向高通量测序的技术原理tHTS是一种基于HTS的靶向富集的测序技术，通过对目标基因组感兴趣区域（regionsofinterest,ROI）进行富集，确保ROI有足够的测序深度和覆盖度，这是确保HTS应用有效的关键步骤，目前，tHTS的靶向富集技术主要分为2种：基于超多重聚合酶链反应（polymerasechainre-action.PCR）扩增的PCR扩增法和基于探针杂交捕获的探针杂交法。1．基于超多重PCR扩增的PCR扩增法其主要流程是针对感兴趣的目标基因区域，利用目的基因区域两侧的序列设计多重PCR引物进行扩增富集，并将这部分区域放大几千倍并进行测序。在核酸序列数量和质量有限的情况下，该方法也可以产生足够的序列进行测序。通常需要多个引物同时工作，得到的扩增序列需要测序适配器连接完成文库制备，之后进行测序分析。2．基于探针杂交捕获的探针杂交法根据目的基因区域设计具有特异性序列的单链寡核苷酸（被称为"探针"或者"诱饵")，这些探针可以是RNA或DNA，与特定基因组序列杂交后分离，以捕获目标基因组序列。捕获成功后进行测序适配器连接和少量PCR循环，以富集成功连接的片段并进行测序分析。与DNA探针相比，RNA探针在与DNA序列结合时具有更好的杂交特性和更高的稳定性，从而提高捕获的总体效率。RNA相对不稳定限制了其使用，而DNA探针应用更为广泛。以上2种方法对比，基于超多重PCR扩增的PCR扩增法具有核酸需求量低，工作流程更快、更简单，脱靶测序率更低，适用于目的基因靶点较少的样本，但其测序失败率相对较高。基于探针杂交捕获的探针杂交法虽然无基因靶点数量的限制，且测序失败率低，但其工作流程更加复杂、核酸需求量高。总的来说，上述这2种方法均适用于HTS目标富集，具体选择哪种方法，应根据测序目的和测序条件综合考虑。与mHTS相比：①tHTS针对特定的病原微生物序列进行扩增，可以减少甚至无视人源序列对检测结果的影响；②tHTS可以同时进行DNA/RNA测序，可以一次检测包括RNA病毒在内的病原微生物；③由于tHTS的病原检测图谱是经过筛选的，检测病原微生物的种类有限，故所需成本更低。二、靶向高通量测序的临床应用1．靶向高通量测序对病原微生物的检测效力传统病原学检测方法，灵敏度低、耗时长。现有的分子诊断方法，如定量聚合酶链反应（quantitativepolymerasechainre-action,qPCR）检测范围窄，mHTS在技术原理上仍存在诸多不足。tHTS作为新兴的HTS，在技术原理上弥补了传统病原学检测的不足，改正了mHTS的一些缺陷。Li等设计了一个包括153种呼吸道感染病原体的tHTS测序平台，可以覆盖95％的常见呼吸道感染病原体。结果显示，102例呼吸道感染患者中tHTS的检出率为82.17%,mHTS为86.51%，两者检出率的差异无统计学意义（P=0.41)。tHTS的成本仅为mHTS的1/4，故在保持高灵敏度的基础上，tHTS在成本方面更具有优势。tHTS可以同时进行DNA/RNA测序，一次测序就可以完成对细菌、真菌、病毒和非典型病原体的检测。此外，tHTS还单独检出了鼻病毒，其在临床应用上更具实用性。临床上常需要面对多种病原微生物引起的感染，这就需要一种能同时检测多种微生物的技术手段。研究表明，Sanger测序在检测多重感染标本时，通常无法解释检测结果。虽然，mHTS有助于多重感染的鉴定，但是并不能有效区分定植菌和病原菌。近年来，有研究提出基于16SrRNA的HTS在多重微生物感染标本中有准确鉴定病原微生物种及定量细菌丰度的能力。Pitashny等进一步探索了基于16SrRNA的tHTS对多重感染的检测效力。研究发现，在Sanger测序阴性的标本中，tHTS检测出8例阳性，均为多重细菌。Robin等纳入了2146例临床实践中的组织和液体标本，包括肺组织、浆膜液、骨组织、脑脊液、脓肿组织、心脏瓣膜等，分别使用培养方法、Sanger测序及tHTS对标本进行检测。在肺组织中，相较于Sanger测序，tHTS的阳性率提高了300%。多重感染标本，tHTS具有强大检测能力，故早期选择tHTS具有重要临床价值。tHTS对低载量微生物、苛养菌的检出也具有优势。研究发现，利用靶向捕获技术结合mHTS可以增加90%病毒核酸的载量，从而扩大目标微生物检测覆盖度，提高检测的可信度。研究表明，通过靶向捕获富集后，检出病毒的序列数增加了674倍，病毒基因组的覆盖度从2.1%提升至83.2%。得益于覆盖度的提高，捕获的tHTS可以用于分析基因组变异度高达58％的指环病毒。由此可见，tHTS在一定程度上降低了检验结果的解读难度，更适合在临床上被广泛使用。综上所述，tHTS对于病原微生物的诊断效力不亚于现有分子诊断技术，且弥补了现有分子诊断技术的部分不足，在临床应用上具有更广的适用范围。此外，在不同类型的临床样本中，tHTS也被证明了其在诊断方面的潜能，具体的诊断效力仍需要更多针对性的研究来探索。2．靶向高通量测序对耐药基因的检测效力基于培养的药敏试验是临床最常用检测耐药细菌的方法，但其过程烦琐、需要专业人员解读结果、灵敏度低。mHTS得到的微生物测序序列数不足样本总序列数的5%，故无法胜任耐药基因的解读任务，而基于tHTS的新一代耐药基因检测技术将有助于临床快速检测耐药基因。Wu等的研究比较了tHTS与表型药敏试验（phenotypicdrugsusceptibilitytesting,DST）对结核耐药基因检测的结果。结果显示，tHTS的灵敏度和特异度分别为97.0％和99.1%，与DST结果高度一致。可见，tHTS对耐药基因的检测具有高度灵敏性。Sibandze等使用tHTS检测患者的粪便标本并同时进行耐药性预测。56例结核患者中tHTS检测出38例（68%)，同时38例阳性患者中的28例(74%）检测出的结核分枝杆菌复合体耐药性预测报告，与痰DST结果高度一致（k=0.82)。tHTS在检测结核分枝杆菌同时可以检测耐药基因，极大地缩短了时间。另有研究发现，结核病患者，tHTS(75.5%）与结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测（GeneXpertMTB/RIF,Xpert）灵敏度(74.5%）高度一致。因此，在结核的诊断中，tHTS具有一定的指导意义。Patricia等纳人了201例支气管肺泡灌洗液样本，分别进行mHTS、tHTS及抗菌药物敏感试验（antimicrobialsusceptibilitytesting,AST)。结果显示，mHTS的总体准确性为67.1%,tHTS的总体准确性为65.6%,2种检测方法具有相似的检测效力。其中，tHTS检测出16种具有耐药标志物的潜在病原微生物，AST检测出13种可评估表型耐药性的病原微生物，tHTS检测出的耐药表型与药敏试验结果的一致率为54.8%。在1例大肠埃希菌与铜绿假单胞菌混合样本中，药敏试验提示大肠埃希菌对美罗培南敏感，而tHTS检测出BLAOXA基因。铜绿假单胞菌产生BLAOXA基因是本例基因型和表型矛盾的原因。该研究认为，tHTS检测耐药基因需要考虑基因的突变、耐药表型和基因型，以制定更完善的结果解读方法。总之，现有的基于tHTS的耐药基因检测技术灵敏度不弱于传统方法，且适用于多种标本。未来随着tHTS的，该技术将部分取代传统药物敏感试验，在指导临床用药方面发挥重要作用。目前，tHTS还存在一些不足：①tHTS的检测结果是根据已知病原体设计的，只能检测设计目标范围内的病原体，无法检测出新发病原体，在临床实践中需要根据具体的需求设计针对性的病原体谱；②测序前的文库制备需要大量人工和时间成本，且操作人员需要具有较高的专业水平。综上所述，tHTS作为一种新兴技术在呼吸系统感染的临床应用中具有极大的潜能。相较于mHTS,tHTS可以针对临床初筛需求设计检测范围，覆盖常见病原体、简化解读流程、靶向扩增针对性提高病原体的检出可信度。未来，随着tHTS的发展，其应用有望得到更大的拓展。王智刚医生的科普号
《小儿雾化全知道：让宝宝呼吸更顺畅》在儿童的健康护理中，小儿雾化治疗是一种常见且有效的手段。本文将全面介绍小儿雾化，帮助家长更好地了解这一治疗方式，为宝宝的呼吸健康保驾护航。一、什么是小儿雾化？小儿雾化治疗是通过雾化装置将药物分散成微小的雾滴或微粒，使其悬浮于气体中，并进入呼吸道及肺内，达到洁净气道、湿化气道、局部治疗及全身治疗的目的。二、小儿雾化的原理雾化治疗主要利用了气体射流原理。雾化器将药物溶液或混悬液转化为微小颗粒，这些颗粒可以随着患者的呼吸进入呼吸道的不同部位，直接作用于病变部位。三、小儿雾化的适用病症1.?呼吸道感染：如感冒、咳嗽、支气管炎、肺炎等。2.?哮喘：雾化治疗可以缓解哮喘发作时的呼吸困难、喘息等症状。3.?过敏性咳嗽：对于由过敏引起的咳嗽，雾化可以减轻炎症反应。4.?喉炎：特别是急性喉炎，雾化可以减轻喉部水肿，缓解声音嘶哑、犬吠样咳嗽等症状。四、小儿雾化的优势1.?药物直达病灶：雾化治疗可以使药物直接作用于呼吸道病变部位，提高药物的局部浓度，增强治疗效果。2.?减少副作用：与口服或注射药物相比，雾化治疗的药物剂量相对较小，减少了全身副作用的发生。3.?使用方便：小儿雾化治疗通常可以在家庭中进行，操作简单方便，减少了患儿往返医院的麻烦。4.?依从性好：对于年龄较小的宝宝，雾化治疗相对容易接受，提高了治疗的依从性。五、小儿雾化的注意事项1.?选择合适的雾化器：应根据宝宝的年龄、病情选择合适的雾化器。一般来说，压缩式雾化器效果较好，但价格相对较高；超声雾化器价格便宜，但雾化颗粒较大，可能影响治疗效果。2.?正确使用雾化器：在使用雾化器前，应仔细阅读说明书，掌握正确的使用方法。包括如何安装雾化器、如何调节雾量、如何清洁雾化器等。3.?选择合适的药物：雾化治疗的药物应根据宝宝的病情由医生开具。家长不要自行购买药物进行雾化治疗，以免发生药物不良反应。4.?注意雾化时间和频率：一般来说，每次雾化治疗的时间为10-15分钟，每天可进行2-3次。具体时间和频率应根据宝宝的病情和医生的建议进行调整。5.?观察宝宝的反应：在雾化治疗过程中，家长应密切观察宝宝的反应，如出现呼吸困难、面色苍白、口唇发绀等异常情况，应立即停止雾化治疗，并及时就医。6.?做好雾化后的护理：雾化治疗后，家长应及时帮助宝宝清洁口腔和面部，以免药物残留引起口腔感染。同时，应让宝宝多喝水，促进痰液排出。六、如何选择合适的雾化药物？1.?支气管扩张剂：如沙丁胺醇、特布他林等，可以缓解支气管痉挛，改善呼吸困难。2.?糖皮质激素：如布地奈德等，具有抗炎、抗过敏作用，可减轻呼吸道炎症反应。3.?祛痰药：如氨溴索等，可以促进痰液排出，改善呼吸道通畅度。七、小儿雾化的误区1.?雾化治疗时间越长越好：并非如此，过长时间的雾化治疗可能会导致宝宝疲劳、不耐受，甚至引起呼吸道黏膜水肿。2.?只要咳嗽就做雾化：雾化治疗应根据病情需要进行，不是所有的咳嗽都适合雾化治疗。如果宝宝只是轻微咳嗽，没有其他症状，可以先观察，不必急于进行雾化治疗。3.?自行调整药物剂量：家长不要自行调整雾化药物的剂量，以免影响治疗效果或引起药物不良反应。总之，小儿雾化治疗是一种安全、有效的治疗方式，可以帮助宝宝缓解呼吸道疾病的症状，让宝宝呼吸更顺畅。家长在使用雾化治疗时，应选择合适的雾化器和药物，正确使用雾化器，注意观察宝宝的反应，做好雾化后的护理，避免陷入雾化治疗的误区。同时，家长还应密切关注宝宝的病情变化，如有需要，及时就医。李想医生的科普号