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华中科技大学同济医学院附属同济医院 器官移植外科

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论文精选-肝移植

反向克隆法大鼠anti-ERK2腺病毒载体构建

发表者:宫念樵 2957人已读

反向克隆法大鼠anti-ERK2腺病毒载体构建[1]

董冲 陈曦林宫念樵* 唐莉 朱国超 陈知水 叶启发

华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究院华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植外科宫念樵

教育部/卫生部重点实验室 武汉 430030

摘要: 目的 正义基因反向克隆法构建大鼠anti-ERK2腺病毒载体。方法 酶切质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2,得到ERK2 cDNA片段,连接到T载体进行测序,经测序正确反向克隆法插入质粒pShuttle中,最后转入AdEasy(tm) XL Adenoviral Vector System系统中得到anti-ERK2基因腺病毒载体。结果 DraI和NotI双酶切鉴定anti-ERK2基因腺病毒载体,发现插入的基因序列与插入方向均符合预期目标。结论 成功构建了大鼠anti-ERK2腺病毒载体,为研究移植排斥中ERK2基因治疗的作用提供了良好工具。

关键词:反向克隆;anti-ERK2; 腺病毒载体

 

Construction of recombinant adenoviral vector carrying

rat anti-ERK2 gene by reverse orientation clone technology

 

Dong Chong, Chen Xilin, Gong Nianqiao, Tang Li, Zhu Guochao, Chen Zhishui  Ye Qifa.

Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College,

Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030

 

Abstract: Objective】 To construct recombinant adenoviral vector carring the anti-ERK2 gene of rat.【Methods】 The plasmid of p3XFLAG-CMV7.1-ERK2 was digested with enzymes, obtained fragment of ERK2cDNA,then connected it to T-vector. After sequencing, it was reversely inserted into the plasmid of pShuttle, at last transcribed it to AdEasy(tm) XL Adenoviral Vector System.【Results】 The plasmid of pshuttle-anti-ERK2 was digested with DraI and NotI enzymes,and found that the sequence and transcription orientation were identical with expectation.【Conclusion】 Recombinant adenoviral vector carring the anti-ERK2 gene been constructed successfully by reverse orientation cloning the target fragment into pshuttle. It provided tools for researching the role of anti-ERK2 gene therapy in graft rejection.

Key words: reverse orientation clone;anti-ERK2; recombinant adenoviral vector

 

 

 

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是胞外刺激传向胞内的信号转导通路交汇点,能将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内,调节细胞一系列生物学反应(如细胞的增殖、分化、转化及凋亡等)。ERK2(extracellular signal-regulated kinases)属丝裂原活化蛋白激酶超家族成员,与细胞凋亡、免疫调节等密切相关,可调节炎症反应以及参与移植排斥反应。器官移植后抑制ERK2激酶的合成、分泌及其活性,可以研究其在排斥反应中的作用。本研究采用正义基因反向克隆的方法,酶切质粒p3XFLAG-CMV-ERK2得到ERK2cDNA片段,构建反义ERK2腺病毒载体,为进一步研究ERK2激酶在移植免疫中的作用及其机制奠定基础。

 

一.材料与方法

1.材料

质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2由得克萨斯大学医学中心Fred L. Robinson教授馈赠;质粒pshuttle购自BD公司;pAdEasy-1 Vector购自美国Strat-agene公司;InsTPAcloneTM PCR Product Cloning Kit(T载体试剂盒)、T4 Ligase购自MBI公司;限制性内切酶SalI、DraI、NotI购自TaKaRa公司;DOTAP脂质体转染试剂盒购自美国Roche公司;PCR回收试剂盒购自美国Omega公司;上游引物p1:5’GAGATCCTAGAACTAGTGGATCCC3’下游引物5’GGGTACCGGGCCCCCCCTCGAG3’由上海生工合成;293细胞(腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系)与大肠杆菌DH5α由我所保存。

 

2.方法

2.1 酶切质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2

内切酶SalI和NotI酶切质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2:双切缓冲液3μL、质粒2μg、NotI4μL、SalI1μL、10×BSA3μL和H2O 4μL,37℃,6h,琼脂糖凝胶回收1.07kb大小的酶切产物,再用内切酶DraI和NotI酶切回收的基因片段,琼脂糖凝胶回收纯化,方法同前。

2.2 反向克隆法构建anti-ERK2腺病毒载体

2.2.1 pT-ERK2载体构建及筛选、鉴定  琼脂糖凝胶回收0.77kb大小的酶切产物,与T载体(记为pT)连接,反应体系(30μl): T载体DNA3μl,琼脂糖凝胶回收纯化产物4μl,10×ligation buffer3μl,PEG4000 solution 3μl,T4DNA ligase1μl(5U),BSA0175μl(500μg/ml),dH2O补充至30μl。22℃连接过夜。钙转法转入感受态DH5α大肠杆菌,取100μl菌液涂布于含60μgPml氨苄青霉素、表层涂有40μlx2gal(20ng/ml)和4μl IPTG (200ng/ml)的LB蓝白斑筛选固体培养基上,37℃孵箱过夜培养。挑取白色单克隆菌落,加入1ml无抗生素LB液体培养基中,振摇3~4h,取4μl菌液行PCR筛选。反应体系:PCR鉴定重组子:10×PCR缓冲液2.5μL、10mM dNTP0.5μL、引物各1.0μL、模板DNA1.0μL、TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5U)、ddH2O 19.5μL,94˚C4min,94˚C30S,57˚C45S,72˚C45S,72˚C10min,共30个循环。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物将经PCR筛选为阳性克隆(重组体命名为pT-ERK2)的菌液于37℃、200r/min条件下振摇过夜,用质粒提取试剂盒提取质粒。重组质粒用DraI和NotI内切酶进行双酶切鉴定,应有0.77kb目的片段。阳性克隆送上海申友公司测序。

2.2.2 反向克隆法构建pshuttle-anti-ERK2载体及筛选、鉴定  首先使用DraI和NotI双酶切pshuttle vector 获得pshuttle片段并经CIAP去磷酸化,同时用这两种酶双切pT-ERK2,而后将两者用T4连接酶连接,ERK2基因就反向插入质粒pshuttle中,从而获得pshuttle-anti-ERK2载体,转化至感受态DH5α细菌中扩增,取100μl涂含50μg/ml卡那霉素的LB(以下简称卡那LB)平板。用PCR法初筛阳性克隆(扩增体系及反应条件同前) ,将阳性克隆接种至5ml卡那LB培养液中振摇过夜,提取质粒后再用上述两种酶进行酶切鉴定,应有0.77kb目的片段。

2.2.3 pshuttle-antiERK2腺病毒载体构建及转染293细胞  将pshuttle-anti-ERK2载体用PacⅠ酶切线性化,反应体系如下:酶切缓冲液5μL、PacⅠ1μL、100×BSA0.5μL、pshuttle-anti-ERK2 3μg和H2O 13.5μL,37℃,6h。将线性化的pshuttle-anti-ERK2在DOTAP 介导下转染293包装细胞(按Stratagene及Roche公司操作说明书进行),形成空斑后,提取空斑内容物经PCR法检测正确后,将阳性空斑内的提取物继续感染293细胞,进行第二次空斑纯化和筛选,得到具有感染能力的pshuttle-anti-ERK2腺病毒载体。

 

 

二.结果

2. 1 酶切质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2产物电泳分析  酶切质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳,在1.07kb左右可见一清晰条带,与预计片段相符(图1),回收1.07kb大小的酶切产物,用内切酶DraI和NotI酶切后在1.0%琼脂糖凝胶上电泳可见在0.77kb左右可见一清晰条带,与预计片段相符(图2)。

          

M:DL2000 marker ;1、2 、3 :质粒酶切电泳结果          M:DL2000 marker ;1、2 、3 :ERK2酶切电泳结果

图1  酶切质粒凝胶电泳结果                          图2  ERK2基因酶切凝胶电泳结果

2. 2 pT-ERK2载体的鉴定  经申友公司测序确定pT-ERK2中目的基因核苷酸序列与基因库(Genbank Acc.#M64300)公布的序列完全一致,序列如下:

1 atggcggcgg cggcggcggc gggcccggag atggtccgcg ggcaggtgtt cgacgtgggg ccgcgctaca ctaatctctc  81gtacatcgga gaaggcgcct acggcatggt ttgttctgct tatgataatc tcaacaaagt tcgagttgct atcaagaaaa tcagtccttt  171tgagcaccag acctactgtc agagaaccct gagagagata aaaatcctac tgcgcttcag acatgagaac atcatcggca tcaatgacat  261catccgggca ccaaccattg agcagatgaa agatgtatat atagtacagg acctcatgga gacagatctt tacaagctct tgaagacaca  351gcacctcagc aatgatcata tctgctattt tctttatcag atcctgagag gattaaagta tatacattca gctaatgttc tgcaccgtga  441cctcaagcct tccaacctcc tgctgaacac cacttgtgat ctcaagatct gtgactttgg ccttgcccgt gttgcagatc cagaccatga  531tcatacaggg ttcttgacag agtatgtagc cacgcgttgg tacagagctc cagaaattat gttgaattcc aagggttata ccaagtccat  621tgatatttgg tctgtgggct gcatcctggc agagatgcta tccaacaggc ctatcttccc aggaaagcat taccttgacc agctgaatca  711catcctgggt attcttggat ctccatcaca ggaagatctg aattgtataa taaattt

2.3 pshuttle-anti-ERK2载体的鉴定  DraI和NotI双酶切pshuttle-anti-ERK2重组载体,1%琼脂糖凝胶电泳,可见大小为0.77kb和4.0kb片段。其中0.77kb片段为p-ERK2,4.0kb片段为pshuttle vector ,p-ERK2片段经核苷酸序列测定法检测与预测结果完全相符(图3)。

                  

图3 pshuttle-anti-ERK2重组载体酶切电泳         

 

2.4 pshuttle-anti-ERK2腺病毒载体的鉴定  将pshuttle-anti-ERK2腺病毒载体转染293细胞后,7天可观察到空斑的产生,提取内容物,经PCR检测得到大小为0.77kb的目的片段,用cDNA阳性空斑冻融悬液感染293细胞,4天后均可观察到细胞肿胀、变圆及蚀斑出现。

 

三.讨论

基因治疗是一种新型的疾病治疗手段,主要通过向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片断,以纠正或补偿患者基因的缺陷、关闭或抑制异常表达的基因,从而达到治疗疾病的目的。基因治疗在器官移植中的应用有天然优势:1,移植器官体外保存的过程为相关的基因治疗提供了操作平台,并同时解决了基因转染的靶向问题;2,在体外将调控基因导入移植器官,术后移植物表达的靶蛋白可以在移植器官局部发挥自身保护作用/免疫调节作用;3,靶蛋白引流入相关二级淋巴器官,可有针对性地调节由移植抗原直接激发的免疫反应,从而表现出治疗的特异性,而无明显全身副作用[1]。治疗基因通过病毒或者非病毒载体进行转染。腺病毒载体与其他载体相比,具有宿主范围广、感染率高、理化性质较稳定、遗传毒性较低等特点,因而获得广泛应用[2]

反义核酸技术是通过人工合成反义RNA ,并将其导入细胞内,转录出反义RNA,封闭其翻译,抑制特定基因的表达,阻断该基因的功能,以了解该基因对细胞生长和分化的影响。ERK1/2是MAPK家族中最早被描述的信号转导通路,包括ERK1和ERK2,广泛存在于各种细胞中,对于细胞周期的运行和基因表达具有重要调控作用[3]。实验证明ERK信号转导通路与炎症有密切关系[4],基因敲除实验发现ERK2可以完全代替ERK1基因敲除鼠中ERK1的功能,而ERK1不能替代ERK2基因敲除鼠中ERK2的功能[5]。通过反义基因抑制ERK2通路,可以明确其在移植后排斥反应中的作用。

本实验通过正义基因反向克隆的方法构建antiERK2腺病毒载体,通过酶切质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2,得到ERK2基因,然后反向克隆入质粒pshuttle中重组,将重组成功的pshuttle-ERk2线性化后转染人胚肾细胞293细胞中,得到具有感染能力的反义ERK2腺病毒载体。合成的反义RNA能与mRNA分子特异性结合,从而抑制该mRNA的加工与翻译。与核拟酶(ribozyme)技术相比校,反向克隆技术具有设计简单、特异性强、操作容易和经济省时的优点。

正义基因反向克隆的方法成功构建的anti-ERK2腺病毒载体为干预ERK2信号转导的研究提供了有力的工具。在信号传导通路水平阻断和调控ERK2的表达和活性,可阻止T淋巴细胞的活化、巨噬细胞的分化以及细胞因子的表达,有助于进一步探讨ERK2通路在移植后排斥反应中的效应。

 

参考文献:

1.Guillot C, Le Mauff B, Cuturi MC, et al. Gene therapy in transplantation in the year 2000: Moving towards clinical applications? Gene Ther , 2000,7: 14-19.

2.JA St George.Gene therapy progress and prospects:adenoviral vectors. Gene Therapy, 2003 ,10:1135-1141.

3.Fred L. Robinson, Angelique W. Whitehurst,et al.Identification of Novel Point Mutations in ERK2 That SelectivelyDisrupt Binding to MEK1. Journal of Biological Chemistry, 2002,277: 14844–14852.

4.Yasutaka Ikeda, Akira Murakami, Hajime Ohigashi.Ursolic acid promotes the release of macrophage migration inhibitory factor via ERK2 activation in resting mouse macrophages. Biochemical Pharmacology,2005,8:1-9.

5. Pagès, G., Guerin, S., Grall, D., et al.Defective thymocyte maturation in p44 MAPkinase (Erk 1) knockout mice. Science, 1999,286:1374–1377.



基金项目:国家自然科学基金资助项目(30300324)

* 通讯作者:宫念樵 Email:nqgong@tjh.tjmu.edu.cn

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发表于:2009-04-24 21:19

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