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医学科研

益气养阴活血通络法干预糖尿病肾病疗效与机制的研究

发表者:郭兆安 1575人已读

项目名称:益气养阴活血通络法干预糖尿病肾病疗效与机制的研究

课题来源:山东省2013-2014年度中医药科技计划项目(编号2013ZDZK—027)

研究人员:郭兆安  于春江  柳刚  李悦  孟凡辰  杨鲁莹山东中医药大学附属医院肾病科郭兆安

完成年限:2013年7月-2015年12月

内容简介:随着经济发展、生活水平提高和生活方式的转变,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患病率显著升高,已经成为我国主要的公共健康问题之一。DEMAND研究发现,来自33个国有共24151例2型糖尿病患者白蛋白尿患病率高达49%。中国国内研究表明,新诊断2型糖尿病患者微量白蛋白尿患病率高达20.7%。资料显示本世纪初糖尿病肾病(diabetes nephropathy,DN)在同期肾活检患者中的比例较上世纪末增长1.68倍 ,DN已成为我国最常见的继发性肾脏病,也是导致慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)的常见病因。一旦发生DN,患者的生活质量就会大大下降,治疗难度以及治疗费用明显增加。大量研究证实蛋白尿的程度是DN患者病情进展的独立危险因素,严格控制DN患者尿蛋白水平已成为延缓病情进展的基础治疗之一,将DN患者尿蛋白控制在10g/24h以下,已经和血糖控制、血压控制共同成为预防DN进展的目标。因此,探索DN的发病机制、寻找有效的早期防治方法具有重要临床意义。近年来,几项大型多中心前瞻性随机临床试验(RENNAL、IDNT等)均证实应用血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(angiotensin Ⅱ receptor blockers,ARB)阻断肾素-血管紧张素体统(renin-angiotensin system,RAS)能够减少DN患者尿蛋白,延缓DN进展,但ARB减少尿蛋白疗效有限,尤其对大量蛋白尿伴肾功能不全的ND患者,疗效不佳,因此,有必要探寻新的治疗方案以进一步减少尿蛋白,延缓DN进展。

中医认为DN为本虚标实之证,气阴两虚为其本,瘀血阻络为其标。对DN不同阶段中医症状及证候分布规律的研究发现,Ⅲ期主要表现为气阴两虚,可兼血瘀、热盛证,Ⅳ期主要表现为气阴两虚夹瘀。本课题组根据上述询证医学证据,结合临床实际,认为益气养阴、活血通络是ND重要治疗原则,临床应用芪蛭降糖胶囊治疗DN,发现该药不仅能改善DN的症状,而且能减少蛋白尿,取得了初步疗效。本课题拟以从临床和实验研究两个方面探讨芪蛭降糖胶囊减少蛋白尿、延缓糖尿病肾病进展的疗效、机理。为临床提供一种有效的药物,以满足广大患者的需要。

本课题拟通过临床研究,观察芪蛭降糖胶囊对DNⅢ期病人的微量白蛋白、一氧化氮和内皮素的影响;观察芪蛭降糖胶囊对DNⅣ期病人24小时尿蛋白定量、血浆白蛋白及肾功能的影响。实验研究,通过建立DN动物模型,观察芪蛭降糖胶囊对DN大鼠肾脏血管的保护作用及对炎症因子的影响;观察芪蛭降糖胶囊对DN大鼠对肾间质纤维化的抑制作用。

实验研究  

芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾实质小动脉内膜/中膜厚度比与炎性因子的影响   目的:观察芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病(diabetic nephropathy ,DN)大鼠肾实质小动脉内膜/中膜厚度比与炎性因子的影响。 方法: 48只清洁级雄性Wistar大鼠按体重随机抽取40只,采用切除右肾加腹腔注射链脲菌素(streptozotocin,STZ)的方法制备DN模型,另外8只大鼠行右肾假切术。造模成功后按血糖高低,两头随机抽取分为模型组、缬沙坦对照组、芪蛭降糖胶囊低剂量组、芪蛭降糖胶囊高剂量组。成模2d起各组给予相应浓度和剂量的药物,分别于4、8、12周观察DN尿蛋白定量(TP)、尿视黄醇结合蛋白(RBP)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)和血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、β2微球蛋白(β2-MG)的变化。12周后,处死所有动物,肾组织行HE染色,光镜下观察肾组织病变,测量肾实质小动脉内膜/中膜厚度比;电镜观察肾小球毛细血管超微结构;免疫组化检测肾组织中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和肾小动脉CD31的表达;原位杂交法检测MCP-1 mRNA在肾组织中的表达;免疫荧光检测肾小动脉α-平滑肌肌动蛋白(α- SMA)表达。 结果:在各个时间点,芪蛭降糖胶囊能明显减少DN大鼠TP、RBP、NAG酶(P<0.01),改善肾功能。HE染色显示,芪蛭降糖胶囊能减轻肾组织及其血管病理损害,比较各组大鼠肾小动脉内膜/中膜厚度比表明,模型组显著高于假手术组(P<0.01),对照组和低剂量组明显低于模型组(p<0.05),高剂量组显著低于对照组(P<0.01)。电镜观察显示,芪蛭降糖胶囊能减轻肾小球基底膜增厚和系膜增生,保护内皮细胞之间窗孔形态,减轻足细胞足突融合。免疫组化检查显示芪蛭降糖胶囊能减少肾组织中MCP-1表达和下调肾小动脉CD31的表达(P<0.01);原位杂交法检测显示芪蛭降糖胶囊能下调MCP-1 mRNA在肾组织中的表达;免疫荧光检测显示芪蛭降糖胶囊能下调肾小动脉α- SMA的表达。结论: 芪蛭降糖胶囊通过下调MCP-1、MCP-1 mRNA在肾组织、CD31和α- SMA在肾小动脉的表达,阻断炎性反应,改善肾组织和血管结构病理损害,从而对DN起到治疗作用。

芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织血管内皮细胞生长因子及细胞外基质的影响  目的:观察芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)大鼠肾组织血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的影响。方法:清洁级6-7周龄雄性Wister大鼠48只,按体重随机取40只,采用切除右肾加腹腔注射链脲佐菌素(strephozotocin,STZ)的方法制备DN模型。模型成功后按照血糖高低排序,两头抽取随机分为模型组、缬沙坦对照组(简称对照组,下同)、芪蛭降糖胶囊低剂量组、芪蛭降糖胶囊高剂量组,每组10只大鼠。另取8只正常大鼠行右肾假切除术,腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为假手术组。成模2d起各组给予相应浓度和剂量的药物灌胃,分别于4、8周观察血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血清胱抑素-C(Cystatin-C)、β2-微球蛋白(β2-MG)、24小时尿蛋白定量(24h TP)、尿微量白蛋白(mALB)、尿微量白蛋白/尿肌酐(UmALB/Ucr)。8周后处死动物,肾组织行HE染色,光镜下观察肾组织病变,电镜下观察肾组织足细胞的变化。免疫组化检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)、纤维粘连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)的表达。结果:在各个时间点,模型组大鼠血Scr、BUN、Cystatin-C、β2-MG,尿24h TP、mALB、UmALB/Ucr均明显高于假手术组(P<0.05),对照组明显低于模型组(p<0.05),中药组显著低于对照组和模型组,且呈剂量依赖关系(p<0.05~0.01)。与模型组和对照组相比,he染色显示芪蛭降糖胶囊能减轻dn大鼠肾组织及其血管病理损害。电镜观察显示,芪蛭降糖胶囊能明显减轻dn大鼠肾组织基底膜增厚、内皮细胞及系膜增生,减轻足细胞足突融合,且呈剂量依赖关系。免疫组化显示vegf、timp-1、fn、colⅳ在模型组的表达较假手术组有明显增加(p<0.05),对照组和低剂量组明显低于模型组(p<0.05),高剂量组显著低于对照组(p<0.01);mmp-9在假手术组表达最明显,模型组显著低于假手术组(p<0.01),对照组和低剂量组高于模型组(p<0.05),高剂量组显著高于对照组和低剂量组(p<0.05~0.01)。结论:芪蛭降糖胶囊可以明显抑制肾组织中vegf的过度合成和沉积,能够有效减轻ecm在肾组织中的积聚,从而改善dn大鼠肾组织和血管结构病理损害。

芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织BMP-7及TGF-β1/smads信号传导通路的影响  目的:观察芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)大鼠肾组织血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的影响。方法:清洁级6-7周龄雄性Wister大鼠48只,按体重随机取40只,采用切除右肾加腹腔注射链脲佐菌素(strephozotocin,STZ)的方法制备DN模型。模型成功后按照血糖高低排序,两头抽取随机分为模型组、缬沙坦对照组(简称对照组,下同)、芪蛭降糖胶囊低剂量组、芪蛭降糖胶囊高剂量组,每组10只大鼠。另取8只正常大鼠行右肾假切除术,腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为假手术组。成模2d起各组给予相应浓度和剂量的药物灌胃,分别于4、8周观察血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血清胱抑素-C(Cystatin-C)、β2-微球蛋白(β2-MG)、24小时尿蛋白定量(24h TP)、尿微量白蛋白(mALB)、尿微量白蛋白/尿肌酐(UmALB/Ucr)。8周后处死动物,肾组织行HE染色,光镜下观察肾组织病变,电镜下观察肾组织足细胞的变化。免疫组化检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)、纤维粘连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)的表达。结果:在各个时间点,模型组大鼠血Scr、BUN、Cystatin-C、β2-MG,尿24h TP、mALB、UmALB/Ucr均明显高于假手术组(P<0.05),对照组明显低于模型组(p<0.05),中药组显著低于对照组和模型组,且呈剂量依赖关系(p<0.05~0.01)。与模型组和对照组相比,he染色显示芪蛭降糖胶囊能减轻dn大鼠肾组织及其血管病理损害。电镜观察显示,芪蛭降糖胶囊能明显减轻dn大鼠肾组织基底膜增厚、内皮细胞及系膜增生,减轻足细胞足突融合,且呈剂量依赖关系。免疫组化显示vegf、timp-1、fn、colⅳ在模型组的表达较假手术组有明显增加(p<0.05),对照组和低剂量组明显低于模型组(p<0.05),高剂量组显著低于对照组(p<0.01);mmp-9在假手术组表达最明显,模型组显著低于假手术组(p<0.01),对照组和低剂量组高于模型组(p<0.05),高剂量组显著高于对照组和低剂量组(p<0.05~0.01)。结论:芪蛭降糖胶囊可以明显抑制肾组织中vegf的过度合成和沉积,能够有效减轻ecm在肾组织中的积聚,从而改善dn大鼠肾组织和血管结构病理损害。

芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏结构和功能的影响  目的:观察芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病(diabetic nephropathy ,DN)大鼠肾脏结构和功能的影响。 方法: 48只清洁级雄性Wistar大鼠按体重随机抽取40只,采用切除右肾加腹腔注射链脲菌素(streptozotocin,STZ)的方法制备DN模型,造模成功后按24hTP高低,两头随机抽取分为模型组、缬沙坦对照组、芪蛭降糖胶囊低剂量组、芪蛭降糖胶囊高剂量组。另取8只大鼠行右肾假切术,腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为假手术组。成模2d起各组给予相应浓度和剂量的药物,给药12周时观察DN大鼠24小时尿蛋白定量(24 huors urine protein quantitative ,24hUPQ)、α1微球蛋白(α1-MG)、β2-微球蛋白(β2-MG)和血糖(Blood sugar,BS)、血清肌酐(Scr)、血清胱抑素-C(Cystatin-C)的变化;测定血浆血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO);留取标本后处死所有动物,肾组织行HE染色、PAS染色、免疫组化染色,光镜下观察肾组织病变,PAS染色计算肾小球硬化指数(glomerulosclerosis index ,GSI)、肾间质纤维化指数(Renal interstitial fibrosis index,IF),电镜观察肾小球毛细血管超微结构;免疫组化检测肾组织转化生长因子(Transforming growth factor ,TGF)-β1的表达。 结果:12周后,模型组大鼠24hUPQ、α1-MG、β2-MG较假手术组显著增多(P<0.01),3个治疗组dn大鼠的24hupq、α1-mg、β2-mg较模型组明显减少(p<0.01),2个中药治疗组较对照组也明显减少(p<0.05~0.01),且呈剂量依赖性;模型组大鼠bs、scr、cystatin-c亦较假手术组显著升高(p<0.01),2个中药治疗组较模型组也明显降低(p<0.05~0.01),对照组bs与模型组相比无明显变化(p>0.05)。3个治疗组血浆AngⅡ、ET-1较模型组显著降低、NO显著升高(P<0.05~0.01)。HE染色显示,2个中药治疗组大鼠肾组织病理损害明显减轻,PAS染色显示2个中药治疗组大鼠肾组织GSI、IF显著减轻(P<0.01)。电镜观察显示,2个中药治疗组DN大鼠肾小球基底膜增厚和系膜增生、足细胞足突融合减轻。免疫组化检查显示2个中药治疗组DN大鼠肾组织TGF-β1的表达显著下调(P<0.01)。结论: 芪蛭降糖胶囊通过抑制AngⅡ的分泌,减轻血管内皮损伤,下调TGF-β1在肾组织的表达,减轻肾小球硬化和肾间质纤维化,改善肾组织病理损害,从而对DN起到治疗作用。

临床研究  

芪蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾病Ⅲ期的临床研究  目的:观察芪蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾病( diabetic nephropathy,DN) Ⅲ期的临床疗效,并探讨其作用机理。方法:将符合DNⅢ期诊断标准的患者按照数字表法随机分为试验组和对照组。两组患者先给予两周的洗脱期治疗,然后给于西医基础治疗,对照组给予缬沙坦80mg,每日1次,试验组给予芪蛭降糖胶囊每次5粒,每日3次。观察尿微量白蛋白(microalbumin,mALB)、尿mALB/肌酐(Urine creatinine,Ucr)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2- MG)、α1-微球蛋白(α1—microglobulin,α1-MG),测定血内皮素-1(endothelin-1,ET-1)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)、6-酮前列腺素F1a(6 - keto prostaglandin F1a,6-K-PGFla), 血生化自动分析仪测定血肌酐(Serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,Bun)、血清胱抑素-C(cystatin-C,Cys-C)、视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein,RBP)、β2-MG。治疗前,治疗后4、8、12周各检查记录1次,并比较动态变化。结果:最终有效纳入病例试验组96例,对照组95例。芪蛭降糖胶囊和缬沙坦均能在各个时间点显著降低尿mALB和mALB/ Ucr(P<0.01),同时间点比较试验组降低幅度大于对照组(P<0.01)。芪蛭降糖胶囊在各个时间点能明显降低尿β2- MG、α1-MG(P<0.05~0.01),对照组只在治疗后12周尿α1-MG低于治疗前(P<0.05)。芪蛭降糖胶囊和缬沙坦均能在各个时间点显著降低ET-1、升高NO(P<0.05~0.01),同时间点比较两组无差异(P>0.05)。

芪蛭降糖胶囊在各个时间点显著降低TXB2、升高6-K-PGFla(P<0.05~0.01),对照组只在治疗后12周TXB2降低和治疗后8周、12周6-K-PGFla升高(P<0.05),同时间点比较两组有统计学差异(P<0.05~0.01)。两组患者治疗前早期肾功能接近正常值高限,试验组治疗后明显改善(P<0.05),对照组无明显变化(P>0.05)。结论:芪蛭降糖胶囊能明显降低DNⅢ期患者的尿mALB及mALB/ Ucr,稳定肾功能,疗效优于缬沙坦,其作用机制与降低ET-1、升高NO,维持TXA2/ PGI2动态平衡,保护血管内皮细胞有关。

芪蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾脏疾病3b期大量蛋白尿的多中心、随机对照研究 目的  观察芪蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease, DKD) 3b期蛋白尿的疗效和安全性。方法  将符合DKD 3b期诊断标准的患者采用随机数字表法分为试验组和对照组,每组84例。两组患者先进行两周的洗脱期治疗,后给予西医基础治疗,对照组予缬沙坦160 mg, 每日1次,试验组给予芪蛭降糖胶囊,每次5粒,每日3次。以随访点为基线、随访1、3、6月,观察指标为血压(收缩压、舒张压)、24 h尿蛋白定量(24 hours urine protein quantitative,24 h UPQ)、血浆白蛋白(albumin,ALB)、血肌酐(serum creatinine,Scr),并计算eGFR。同时观察记录两组患者低血糖反应、凝血功能异常、胃肠道反应、过敏反应、高钾血症、肌酐倍增及总体不良事件的发生率。结果  最终纳入有效病例试验组81例,对照组80例。随访1、3、6月,试验组24 h UPQ均显著低于基线水平(P < 0.01),分别较基线下降22.3%、36.2%、45.75%,同时也低于同期对照组 (P<0.05),对照组随访1、3、6月24 h UPQ与基线水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。试验组ALB呈上升趋势,在随访的第6月明显高于本组基线水平(P<0.05),也高于对照组同期水平(P<0.05),对照组ALB水平无明显变化。两组患者Scr均呈升高趋势,在随访的3月、6月,试验组肌酐均高于基线水平(P<0.05),升高的幅度分别为2.1%、10.2%、21.8%;而对照组Scr升高的幅度高于试验组,3次随访均明显高于基线水平(P<0.05),升高幅度分别为8.3%、22.5%、41.4%。两组eGFR呈下降趋势,对照组下降幅度高于试验组(P<0.05)。试验组肾功能进展例数分别为0例(0.0%)、8例(9.55%)、18例(21.4%),对照组分别为7例(8.3%)、18例(21.4%)、34例(40.5%),随访3、6月时,两组肾功能进展例数比较差异有统计学意义(P<0.05)。两组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。 结论  芪蛭降糖胶囊能有效降低DKD 3b期患者蛋白尿,延缓肾功能进展,其疗效优于ARB。

发表文章  1.李悦,于春江,郭兆安,等 芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾实质小动脉内膜/中膜厚度比与炎性因子的影响。中国中西医结合肾病杂志,2013,14(10):858-863。

2.孟凡辰,郭兆安,于春江,孙春晓,武帅,袁婷,李悦,贾佑铎. 芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织血管内皮细胞生长因子及细胞外基质的影响。中国中西医结合肾病杂志,2014,15(8):676-681。

3.武帅,郭兆安,于春江,李悦,姜蓓蓓,肖荣,李敏,刘玉臻,董雄飞. 芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织BMP-7及TGF-β1/smads信号传导通路的影响。中国中西医结合肾病杂志,2014,15(4):297-301。

4.郭兆安,孟凡辰,于春江. 芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏结构和功能的影响。中国医药科学,2015,5(1):31-36。

5.郭兆安,于春江,李悦,等.芪蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾病Ⅲ期的临床研究。中国中西医结合急救杂志,2013,20(5):5-9。

6.郭兆安,于春江,柳刚,孟凡辰,李悦, 彭书玲. 芪蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾脏疾病3b期大量蛋白尿的多中心、随机对照研究。中国中西医结合杂志,2014,34(9):1047-1052.

课题水平:国际先进水平  鉴定证书:鲁卫中科鉴字[2015]第50号。

获奖级别:山东中医药科学技术奖三等奖(获奖证书编号Z-2016-1-348-1)

获奖时间:2016年9月。

本文是郭兆安医生版权所有,未经授权请勿转载。

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发表于:2014-01-10 15:11

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