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糖尿病患者家系基因突变分析及产前诊断

发表者:韩连书 人已读

(发表在:中华围产医学杂志,2012,(8):427-432)

摘要目的  分析枫糖尿病(maple syrup urine disease,MSUD)患者家系基因突变情况以及对产前诊断的作用。方法  利用聚合酶链反应技术扩增BCKDHABCKDHB基因外显子编码区序列,直接测序分析BCKDHABCKDHB基因突变情况。在患儿母亲再次妊娠16~20周时抽取羊水细胞,对培养后的羊水细胞进行相应基因突变检测,用于产前诊断。 结果  4例患儿中共检测到6种不同的基因突变,包括4种新突变(c.308T>C、 c.562G>T, c.1279C>G,c.1280-1291del12)。其中在3个家系的BCKDHA基因上检测到5种突变(c.308T>C、 c.562G>T、c.868G>A、c.1279C>G及c.1280-1291del12) ,另一个家系在BCKDHB基因上检测到c.853C>T 1个突变。4例患儿母亲再次妊娠羊水细胞中毎例都检测到1个先证者携带的突变,提示胎儿为MSUD杂合子。结论  通过家系BCKDHABCKDHB基因分析,初步了解MSUD患者的基因突变情况,并成功应用于产前诊断,为MSUD家庭提供帮助。上海新华医院儿童内分泌科韩连书

【关键词】枫糖尿病BCKDHA基因;BCKDHB基因;产前诊断

Analysis of the gene mutations and prenatal diagnosis in the families with maple syrup urine disease

  Yang Nan*, Zhang Li-qin#, Han Lian-shu, Ye Jun,Qiu Wen-juan,Zhang Hui-wen, Gong Zhu-wen, Zhang Ya-fen, Zhu Jian-xing,Gu Xue-fan. *Department of Pediatric Endocrinology, Genetic and Metabolic Disease, Shanghai Institute of Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China. # Qingdao city women and children's health care center, Qingdao 266011,China

Corresponding author: Han Lian-shu, Email: xhhanlianshu@Yahoo.com.cn

Yan Nan and Zhang Li-qin are the first authors who contributed equally to the artical.

AbstractObjective  Maple syrup urine disease(MSUD) is a rare metabolic disorder caused by a deficiency of the activity of the branched-chain 2-keto acid dehydrogenase complex. The complex contains the E1α, E1β and E2 subunits which are encoded by the BCKDHA, BCKDHB or DBT genes respectively. Mutation in any gene causes maple urine disease. The aim of this study was to analyze the gene mutations of four cases with MSUD and carry out prenatal diagnosis for these 4 families. Methods  The coding regions of BCKDHA gene and BCKDHB gene were amplified by polymerase chain reaction and analyzed by direct DNA sequencing. During 16 to 20 weeks of pregnancy,the amniotic fluid of each patient's mother was drawn out. The gene mutations carried by probands were analyzed after the amniocytes were cultured. Results  Mutation analysis revealed six variants in four probands, including four novel mutations and two previously reported mutations. Four missense mutations(c.308T>C, c.562G>T, c.868G>A and c.1279C>G) and one deletion were detected on BCKDHA gene in 3 patients. While one nonsense mutation(c.853C>T) was found on BCKDHB gene in one patient. Only one gene mutation carried by each proband were found in the amniocytes of these four patients' mother respectively. The results indicated that these fetuses were MSUD heterozygous. Conclusion  Through the analysis of the gene mutations, the mutations of 4 families were known, and were applied on the prenatal diagnosis for these families. This was help to have a healthy child for the families with MSUD.

【Keywords】maple syrup urine disease; BCKDHA gene; BCKDHB gene; prenatal diagnosis

糖尿病(maple syrup urine disease,MSUD,OMIM 248600)是一种支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)代谢紊乱疾病,属于常染色体隐性遗传病,是由于支链α-酮酸脱氢酶复合体(branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex,BCKD)活性降低导致的一种罕见疾病,总体患病率约为1︰185 000[1],但在门诺派教徒人群患病率较高为1︰380[2]。此复合体由支链α酮酸脱羧酶(E1a)、b支链酮酸脱羧酶( E1b)和双氢脂酰转环酶(E2)亚单位组成,其编码基因分别为BCKDHA, BCKDHBDBT,其中任何一个基因发生突变都会导致此病。由于BCKD酶活性降低,E1a受阻,造成支链氨基酸和支链α-酮酸积聚在体内,对脑组织产生神经毒性作用,导致进行性神经退化性病变。BCKD是由E1α、E2、特异性激酶和特异性磷酸酶组成的立方体结构,由6条基因的编码产物构成。根据基因突变MSUD分为Ⅰa型(OMIM 608348) (编码E1α亚基的BCKDHA基因突变)、Ⅰb型(OMIM 248611) (编码E1β亚基的BCKDHB基因突变)、Ⅱ型(OMIM 248610) (编码E2 亚基的DBT基因突变),Ⅲ型(OMIM 238331) (编码E3 亚基的DLD基因突变)[1],Ⅳ型和Ⅴ型分别为特异性激酶和磷酸酶基因突变型。迄今有关BCKDHABCKDHBDBT的基因突变报道已有150余种,E3基因突变报道较少。本研究对4例中国MSUD患儿及其父母进行BCKDHABCKDHBDBT基因突变检测,并对这4个家系进行产前诊断。

资料与方法

一、         研究对象及诊断标准

MSUD患儿4例,男2例,女2例,发病年龄分别为生后2、5、10和26 d,发病日期分别为2005年3月17日、2010年8月2日、2005年10月24日、2008年6月23日。1例家系父母为近亲婚配,其余3例家系父母非近亲婚配。

诊断标准:(1)病时喂养困难、嗜睡、肌张力异常、抽搐、尿中焦糖样异味等;(2)血串联质谱检测亮氨酸(正常值50~300 μmol/L)、缬氨酸增高(正常值60~250 μmol/L)及尿检测多种a-酮酸增高;(3)基因检测发现突变位点[1]。这4例患儿母亲再次妊娠时,要求进行产前诊断。签署知情同意书后行家系基因突变分析和产前诊断。

二、研究方法

1.外周血白细胞采集:征得患儿家长同意后,取患儿及其父母外周静脉血,分离白细胞,提取DNA。

2.羊水细胞采集及培养:患儿母亲再次妊娠(均是与同一配偶妊娠)16~20周时经羊膜腔穿刺术抽取羊水20 ml,取2 ml用于气相色谱质谱检测支链α-酮酸,其余羊水添加培养因子及20%胎牛血清培养2~3周后,收集细胞进行BCKDHABCKDHB基因突变检测。

3KDHABCKDHB基因检测:首先对患儿和其父母基因组DNA进行基因检测,然后对羊水细胞进行相应突变检测。BCKDHA基因包含9个外显子,BCKDHB基因包含10个外显子,应用Primier 5.0软件参照文献[3]对BCKDHA基因和BCKDHB基因编码区分别设计了9对和10对引物。扩增反应体系为50 ml:包含200 ng基因组DNA、5 ml dNTPs(1.25 mmol/L)、1 ml引物(12.5 mmol/L)、5 ml 10×TaqDNA聚合酶缓冲液、1 mlTaqDNA聚合酶、加灭菌蒸馏水至终体积50 ml。反应条件如下:95℃预变性1 min,95℃变性30 s,56~60℃退火30 s,72℃ 45 s进行34个循环,72℃再延伸10 min。经纯化后进行DNA测序(ABI377测序仪,上海生工生物公司)。测序结果采用Chromas软件分析,并与GenBank人类BCKDHA基因(NM_000709)、BCKDHB基因(NM_000056)进行比较,突变外显子均行双向测序。

   

一、      临床资料 

4例患儿均在新生儿期发病,临床表现为经典型,主要有呕吐、嗜睡、纳差、惊厥、肌张力增高、喂养困难等症状,其中2例患儿头颅磁共振检查发现脑内广泛异常信号影。4例患儿对维生素B1治疗均无反应,只能用不含亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸营养粉治疗。4例患儿中1例诊断后不久未及时治疗死亡,余3例进行了治疗,1例依从性较差,间断治疗,2例依从性较好,坚持治疗并定期随访。发病后即开始随访,随访时间1~6年,治疗后的3例患儿仍有智力落后、运动发育迟缓等表现,其中间断治疗的患儿智力落后更严重,表现为不会说话、运动障碍。。

 

 

表1    4例枫糖尿病患儿临床资料

家系编号

发病年龄(d

发病时表现

随访时间

随访结果

智力测试

头颅磁共振

1

10

喂养困难、嗜睡、肌张力高、尿异味

2005-10-27~2012-01-01

6岁,不会说话

Wechsler评分47分

脑干、大脑脚、基底节异常信号

2

2

反应差、抽搐、尿异味

2008-11-15~2012-01-01

6岁,智力落后

Wechsler评分54分

未做

3

26

嗜睡、昏迷、尿异味

2008-05-28~2008-07-02

1月龄死亡

--

未做

4

6

喂养困难、嗜睡、肌张力高

2010-08-12~2012-01-01

14月不会坐

Gesell评分<60分

脑水肿、侧脑室增大

 

2   4例枫糖尿病患儿血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结果

家系编号

血串联质谱检测结果

 

尿气相色谱质谱检测结果a

亮氨酸(mmol/L)

缬氨酸 (mmol/L)

亮氨酸/苯丙氨酸

 

2-羟基异戊酸

2-酮异戊酸

2-酮-3-甲基戊酸

2-酮-异己酸

乙酰甘氨酸

1

999

497

16

 

362

58

295

889

549

2

2132

1082

27

 

366

95

151

356

176

3

2464

411

76

 

0

27

98

376

284

4

1073

573

25

 

479

16

64

697

368

参考值

50~300

60~250

<1.60

 

0

<0.1

0

0

<0.1

a为检测物离子强度与内标17-烷酸离子强度的比值

二、BCKDHABCKDHB基因检测结果 

4个家系的基因检测结果见图1及表2。1号家系患儿仅检测到1个BCKDHA基因突变,且羊水细胞检测到1个相同的突变,未检测到其他突变;其余3个家系患者均检测到2个突变,羊水细胞均检测到1个突变。患儿母亲再次妊娠羊水细胞中分别检测到1个先证者携带的突变,提示胎儿为MSUD杂合子。家系2和3的突变均发生在BCKDHA基因上,家系4的突变发生在BCKDHB基因上。另外,2号家系患儿、父亲和胎儿携带多态性位点c.972 C>T(F324F)[4]、c.1221A>G(L407L)(HGVbase SNP000008700)均为同义突变。

 

 

1  4例家系患儿基因突变检测结果   ①②为3号家系患儿检测到的2个杂合突变;③为1号家系患儿检测到的1个杂合突变,图示为反向测序图谱;④⑤为2号家系患儿所检测到的2个杂合突变;⑥为4号家系患儿所检测到的1个纯合突变

 

3  4例 MSUD患儿家系BCKDHABCKDHB基因突变检测结果

家系

成员

基因

突变1

突变2

纯合或杂合

1

患儿

BDKDHA

c.868G>A(G290R)

未发现

杂合突变

 

父亲

BDKDHA

未发现

-

-

 

母亲

BDKDHA

c.868G>A(G290R)

-

杂合突变

 

胎儿

BDKDHA

c.868G>A(G290R)

-

杂合突变

2

患儿

BDKDHA

c.1279C>G(L427V)

c.1280-1291del12

杂合突变

 

父亲

BDKDHA

c.1280-1291del12

-

杂合突变

 

母亲

BDKDHA

c.1279C>G(L427V)

-

杂合突变

 

胎儿

BDKDHA

c.1279C>G(L427V)

-

杂合突变

3

患儿

BDKDHA

c.308 T>C(103P)

c.562 G>T(G188W)

杂合突变

 

父亲

BDKDHA

c.562 G>T(G188W)

-

杂合突变

 

母亲

BDKDHA

c.308 T>C(103P)

-

杂合突变

 

胎儿

BDKDHA

c.562 G>T(G188W)

-

杂合突变

4

患儿

BCKDHB

c.853C>T(R285X)

c.853C>T(R285X)

纯合突变

 

父亲

BCKDHB

c.853C>T(R285X)

-

杂合突变

 

母亲

BCKDHB

c.853C>T(R285X)

-

杂合突变

 

胎儿

BCKDHB

c.853C>T(R285X)

-

杂合突变

注: -为检测对象未发现第2个突变。

  

MSUD根据发病时间和病情进展情况分为5型:(1)经典型;(2)中间型;(3)间歇型;(4)维生素B1有效型;(5)二氢硫辛酰胺酰基脱氢酶缺乏型。本研究4例患儿均于新生儿期出现嗜睡、喂养困难、尿异味等症状,并出现惊厥、肌张力增高等神经系统症状,其中1例患儿1月龄时因难治性酸中毒死亡。综合以上特点,可明确该4例患者均为经典型。由于经典型MSUD患者新生儿期常出现反应差、嗜睡等非特异性症状,因此对疑似患者应及时进行血、尿氨基酸检测以便早期诊断。本科室曾报道利用串联质谱联合气相色谱-质谱技术检测诊断该病[5]。本研究4例患者在新生儿期即通过血串联质谱及尿气相色谱质谱检测得以诊断。患儿血中亮氨酸显著增高,最高水平达正常参考值上限8倍以上;缬氨酸和亮氨酸/苯丙氨酸比值亦明显增高。尿气相色谱质谱检测尿中α-酮酸发现,尿中2-羟基异戊酸、2-酮异戊酸、乙酰乙酸、2--3-甲基戊酸、2--异己酸及乙酰甘氨酸显著高于正常参考值。经典型MSUD需要早期治疗,强调诊断后立即干预,从而改善其预后。本研究中,1例患者于新生儿期死亡,1例患儿因家长放弃治疗,智力严重落后,余2例治疗依从性较好,但仍出现智力落后、运动发育迟缓等神经系统损害表现,可能与胎儿期及新生儿期中枢神经系统受损有关。故对于新生儿期无明确原因出现神经系统异常者,需要尽快进行血串联质谱及尿气相色谱质谱检测,以便早期诊断早期治疗。由于MSUD是致死、致残的遗传性疾病,患者治疗困难,且预后不良。对于有生育患儿风险的夫妇进行产前诊断,是防止MSUD患儿出生的重要手段。通过对MSUD先证者进行基因诊断,再为先证者母亲妊娠后进行产前诊断,可提高产前诊断的准确性。

有关MSUD基因突变研究,目前已报道150余种 [6],不同种族存在不同的热点突变。发病率最高的门诺派教徒社区最常见突变为BCKDHA基因c.1312T>A(p.Y393N),该突变预计携带率高达10%[2];也有报道其他源自同一祖先的非门诺派教徒人群常见突变为c.1312T>A (p.Y393N)[7]。葡萄牙报道在吉普赛社区BCKDHA基因热点突变为c.117delC(p.R40GfsX23)[8]。亚洲人群中,韩国报道了3MSUD患者5个位于BCKDHA基因上的突变[9];泰国有1BCKDHA基因产前诊断的报道[10],胎儿及父母携带c.529C>T(p.Q177X)无义杂合突变;中国地区尚未检索到有相关突变类型和频率的报道。本报道4例患儿中的1号、2号、3号家系患者基因突变存在于BCKDHA上,确诊为MSUDa型,4号家系患者基因突变存在于BCKDHB上,确诊为MSUDb型。

BCKDHA基因上常见突变c.868G>A(p.G290R),最初由Chuang[11]报道1例轻型患者携带纯合突变(报道为p.G245R)2006Rodríguez-Pombo [12]报道2例症状较重的间歇型携带杂合突变。本研究中,1号家系携带该突变。G290-α可以保证支链α-酮酸脱氢酶复合体的环状结构的紧密结合,G290-α位于亚单位α-α’表面结合袋,推测G290R突变妨碍了α-α亚单位的结合,由此导致α2β2亚单位之间的组装错误引起酶活性下降[12]。葡萄牙人群中的热点突变c.117delC(p.R40GfsX23)引起读码框移,在下游23个密码子处出现终止密码子,形成截短蛋白,仅含61个氨基酸残基,很快从线粒体中被清除[13]。同时,由于终止密码子出现在非常靠前的位置上,所以相应的mRNA被无义介导降解清除,甚至不会产生截短蛋白[14]。本研究发现的BCKDHA基因突变中,除了c.1280-1291del12突变外,c.308 T>C(p.L103P)c.562 G>T(p.G188W)c.868G>A(p.G290R)c.1279C>G(p.L427V)突变均为错义突变。根据E1的晶体结构, L103-α可能在疏水核的临界位点,在这个位点上,4个环状结构通过疏水键结合在一起。该位点突变L103P可能打破疏水核的结构[15]G188-α位于亚单位结合区,G188W突变可导致E1亚单位组装异常从而影响酶活性。3号家系患儿的基因型为c.[308 T>C(L103P))+ 562 G>T(G188W)],出生后26 d发病,临床表型为经典型,提示这2个致病突变对酶活性影响较大。c.1279C>Gp.L427V)和c.1280-1291del12p.L427LfsX20)发生在C-末端残基处,C-末端残基的突变影响亚基的正确组装和α2β2的自然结构形成。同时,L427-α位于亚单位结合区的延伸端,该延伸端对酶的催化中心的活性至关重要[16]。所以无论是该区域的错义突变还是缺失突变,都严重影响酶活性,与基因型c.[1279C>G(L427V)]+ [1280-1291del12(L427LfsX20)]相一致。4号家系突变位点为c.853C>T(p.R285X)。该突变为已报道突变,导致终止密码子提前出现,产生截短蛋白。

4例患儿母亲再次妊娠时羊水细胞的基因检测分别找到1个先证者携带的基因突变,患儿母亲再次妊娠羊水细胞中分别检测到1个先证者携带的突变,提示胎儿为MSUD杂合子。培养后的羊水细胞排除了母源细胞污染的可能。目前尚未开展支链α-酮酸脱氢酶酶活性检测,故对MSUD患者母亲羊水细胞进行基因检测对产前诊断有重要意义。另外,羊水气相色谱质谱检测支链a-酮酸均正常,进一步排除胎儿患病的可能性。已有研究证实,利用气相色谱质谱技术检测羊水有机酸进行有机酸血症的产前诊断,方法可靠[17]

本研究通过家系BCKDHABCKDHB基因分析,初步了解MSUD患儿的基因突变情况,并成功应用于产前诊断,为MSUD家庭提供帮助,如胎儿为纯合子,即为患儿,需要引产。

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发表于:2012-11-03 08:57

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