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江伟凡

副主任医师 讲师

南昌大学第二附属医院 泌尿外科

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学术前沿

男科实验室诊断指南-中华男科学会诊疗指南系列

发表者:江伟凡 1895人已读

 前  言

随着男科学领域的快速发展和国际交流的广泛、深入,对男科实验室诊断的标准化的共识日益增强,从而促使《男科实验室诊断指南》的编写。目的在于进一步规范目前男科实验室检测方法,以达到更好的标准;提高精液分析及其他相关分析的质量,使不同实验室的分析结果具有可比性,从而满足研究人员和临床医生的需要,并可减少重复检查给病人带来的沉重经济负担。南昌大学第二附属医院泌尿外科江伟凡

 

 

                      男科实验室诊断的分类

 

男科实验室诊断以精液、血液、前列腺液和尿道分泌物分析为主,必要时可以采集分泌物进行培养来诊断。男科实验室诊断包括男性不育症、性功能障碍(主要是勃起功能障碍)、前列腺疾病、性传播疾病等的实验室诊断。男性不育症实验室诊断项目可分为:①精液常规分析,包括精液量、PH值、液化时间、精液粘稠度、精子密度、精子活力等的分析,也可包括精子存活率和精子形态学分析,但需临床医生特别注明,因为精子存活率和精子形态学分析均需要特殊的染色方法;②精浆生化指标的检测,目前常用的指标为精浆@葡糖苷酶、酸性磷酸酶和果糖的检测,有些实验室也开展了精浆锌和肉毒碱水平的检测;③精液白细胞和生精细胞的检测;④抗精子抗体的检测;⑤精液培养及精子功能的检测,其检测意义尚不明确,开展较少。性功能障碍的实验室诊断主要为生殖激素的测定。前列腺疾病的实验室诊断主要包括前列腺按摩液的检测和前列腺特异性抗原(PSA)的检测。性传播疾病的实验室诊断主要包括淋病双球菌、支原体、衣原体等的检测。遗传性疾病的实验室诊断主要为染色体的核型分析和各种特异性基因的检测。 

 

第一节           男性不育症的实验室诊断

一、    精液样本的采集

精液采集需要注意以下几点:

1、受检者采集精液前,实验室工作人员需要给受检者提供清晰的书面或口头指导,需要询问禁欲时间和受检目的,同时提供留样容器,并嘱咐留样时的注意事项。如果受检者不在实验室提供的房间留取精液,还应告诉受检者如何转动精液标本。

2、标本采集时间通常为禁欲2-7天。如果需要进行精浆@葡糖苷酶的检测,禁欲时间应为4-7天,因为禁欲2-3天留取精液所测精浆@葡糖苷酶水平34.04土11.22U/ml明显低于禁欲4-7天47.25土17.54U/ml留取的精液标本。如果仅仅是为了观察受检者精液中有无精子,禁欲时间没有严格的限制。

3、标本的采集最好在实验室提供的房间内单独进行。如果在实验室提供的的房间内留取标本确实有困难,可以允许受检者在家里或宾馆里留取精液标本,但必须向受检者强调以下几点:①不可用避孕套留取,因为普通的乳胶避孕套可影响精子的存活;②不可用夫妇射精中断法,因为这很容易丢失部分精液或受到阴道分泌物的污染,尤其是初始部分的精液所含精子密度最高;③在运送到实验室的过程中,标本应避免过冷或过热,尤其是冬天,标本通常置于内衣口袋里送检;④在采集标本后1小时内送到实验室。

4、应用手淫法留取精液,射入一洁净、干燥、广口的玻璃或塑料容器中,留取后置于35-37℃水浴箱中液化。如果需要进行精液培养,受检者应先洗净双手和消毒阴茎,然后将精液射于一无菌容器中。留取精液必须采集完整。

5、采样容器中必须标明受检者姓名、采集时间、禁欲时间、以及样本采集是否完整。

6、受检者最初的精液检测正常,可不必再次检测。如果首次精液检测结果异常,应再次留取精液标本供分析,2次精液标本采集的间隔时间通常为7-21天。

7、实验室技术人员应注意自身安全防护。精液标本应视为生物危险品,其可能含有有害的感染物质,如HIV病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒等。实验室技术人员必须穿上实验室外罩,常规洗手,在实验室内决不允许饮食、吸烟、化妆、贮存食物等。

 

二、精液常规分析

精液常规分析包括精液量、精液外观、液化时间、PH、粘稠度、精子密度、活力与活动率、存活率以及形态学分析等。

(一)精液量

WHO推荐使用的精液量测定方法有两种,一是用锥形底的刻度量筒法,二是称重法。因称重法与精液密度有关,故推荐以刻度量筒法检测精液量为好。不推荐用目测法来检测精液量。

    精液量的正常参考范围为2~6ml。发现精液量少时,应注意询问收集方式是否正确,或鉴别是否有逆行射精,此时可嘱咐患者留取尿液,显微镜观察尿液中是否有大量精子,必要时尿液可离心后再镜检。

    临床意义:精液量少于0.5ml,为无精液症;0.5~2ml为少精液症;多于6ml为多精液症。无精液症常见于不射精或逆行射精;少精液症在排除人为因素如性生活频度高、精液收集不完整后,常见于附属性腺感染、不完全性逆行射精和精囊的发育不全;多精液症常见于附属性腺功能亢进。

(二)外观

    正常精液外观呈乳白色、均质、半流体状液体。临床意义:长时间未排精的人射出的精液略带淡黄色,老年男性精液呈暗黄色。精液清亮、透明常见于无精子或少精子症男性;精液呈棕红色或带血,称为血精,常见于精囊性炎、前列腺炎等生殖系统疾病,也可于苗勒管囊肿、结石、肿瘤如前列腺癌、输精管的微小损害等。

(三)液化时间

    精液标本留取后应充分混匀(但不能剧烈摇动),置于35℃~37℃水浴箱中待其液化。正常精液标本在60分钟内液化,但通常情况下在15分钟内精液液化即完成。因此,精液液化后即可进行精液常规指标的检测。

男科实验室常常会遇到液化不全的精液标本,如果不进行处理,将会影响到检测结果的准确性。对于液化不全精液标本,可以加入1%的10mg/ml的靡蛋白酶,混匀后置37℃水浴箱中温育30分钟后,精液液化可明显改进,此操作不影响精浆生化指标包括@葡糖苷酶、酸性磷酸酶和果糖的检测,但精子运动指标中直线性可显著降低(P=0.025),侧摆幅度可显著升高(P=0.029),而其他指标如精子密度、活动率、a+b级活动率、直线运动速度、曲线运动速度、鞭打频率、平均路径速度等不受影响。机械混匀或菠萝蛋白酶对促进精液液化可能也起作用。这样的操作应记录在检测报告上。

临床意义:精液液化不全在排除人为因素(射出精液的第一部分丢失)后,常见于前列腺疾病,特别是和前列腺炎有关。

(四)PH值

    推荐有PH试纸进行检测。将一滴混匀精液在PH试纸上均匀展开,30秒钟内,与标准带进行比较读出其PH值。

    正常精液PH值为7.2~8.0。

    临床意义:当附属性腺或者附睾有急性感染性疾病时,精液的PH值可以大于8.0.当输精管阻塞或先天精囊腺缺如时,均可导致精液PH值降低。测定精液PH值应在精液液化后立即测定,因为精液放置时间较长会影响PH值测定结果。

(五)粘稠度

    一般用一滴管吸入精液,而后让精液依靠重力滴落并观察拉丝长度,如果长度大于2厘米,视为异常。也可以用一玻棒插入精液中,提起玻棒,观察拉丝长度,同样视长度大于2厘米为异常。粘稠度增加,与精液液化不全一样,同样会影响精液分析结果,处理方法同液化不全精液标本。

(六)精子密度

    精子密度检测结果的准确性主要取决于精子计数池。尽管WHO手册推荐使用改良牛鲍氏血细胞计数板作为精子计数池。并且建议了质量控制方法,但许多其他类型的计数池亦被引入男科学实验室,包括一次性计数池如DROP、Standard Count、Cell Vision 、MicroCell等,它们均为20μm深,精液无需稀释即可直接分析,均为通过毛细管作用加样的计数池;反复使用的计数池,包括2X-CEL、Makler、JCD、Burker及血球计数池,前两者池深20μm,精液无需稀释即可分析,而后三者精液均需作1:20稀释;以及既可一次性又可反复使用的Cell-VU计数池。这些计数池的精确性和准确性已被广泛地评价和比较。

 

 

【注】血细胞计数板,又称牛鲍氏板,用于精液分析已有50余年的历史。目前仍然是我国大多数单位用于精液分析的主要工具。国际上血细胞计数板被认为是精子计数的“金标准”。对于血细胞计数板是否为精子计数的“金标准”,不同学者的实验结果反映不一。WHO组织编写的《人类精液及精子—宫颈粘液相互作用实验室检验手册》第4版仍推荐使用血细胞计数板。血细胞计数板的不足之处在于精液需要稀释,而稀释后的精子丧失了运动能力,因此不能用来分析精子的活力和活动率等运动功能指标。而且,粘稠的精液样本稀释后,由于水合分子和水合离子的形成,以及水分子与蛋白质分子的相互作用,稀释后的总体积并不等于稀释前两者体积之和,而是总体积降低,因而精子密谋相对增高。另外,血细胞计数板多次重复使用造成的磨损同样会影响到以后分析结果的准确性,结果亦倾向于增高。因此,目前的研究认为,血细胞计数板明显高估精子密度。

Micro计数板在我国男科学实验室也有一定的市场,它主要作为CASA系统的配套产品。Micro计数板的基本原理同Makler计数板,池深10μm,盖板的盖玻片有1mm和0.4mm两种,前者适合于在20×或25×物镜下观察,后者可在普通显微镜40×物镜下观察。盖板上可有或无计数网格,也有不刻网格的盖板。未刻有计数网格的盖板多用于CASA系统,可同时分析精子活动率,而有计数网格的盖板,网格刻在盖板中央,为100个0.1mm×0.1mm的小方格。计数时,取液化后充分混匀的精液5μl滴加在载物平台上,轻轻盖上盖板,随机计数10个小方格内的精子数乘以106/ml,即为精子密度。若精子密度<20×106/ml,应计数更多的小方格,使计数的精子总数达200条以上。 

    最近,Cell-VU计数板备受关注,研究显示,不论是标准乳胶珠溶液、精子悬液还是精液标本,Cell-VU计数池的计数结果总是最低,最接近标准乳胶珠溶液浓度的参考值,而血球计数池和Makler计数池的计数结果明显高估。而且,Cell-VU可一次性或反复多次使用,这在计数传染性较强的样本时将显示出独特的优势。

    Cell-VU计数池由载玻片和0.5mm厚的盖玻片构成,每个载玻片有两个计数池,可同时配有两个盖玻片。盖玻片中央有激光蚀刻的网格,网格区为1mm×1mm,均为分100个0.1mm×0.1mm的小方格。计数池的深度为0.02mm。计数时,取液化精液4μlh上样,盖上盖玻片,避免气泡产生。按数上不数下、数左不数右的原则计数10个或50个小方格的精子数,以保证每次计数不少于200条精子。结果÷10×106/ml即为测定的精子密度。

    为了保证所有男科实验室检测结果的准确性,以及不同实验室的检测结果具有可比性,必须建立一个标准的计数池操作系统用于所有实验室,从而为不同实验室的精液质量控制评价提供基础。基于目前的形容并结合我国国情,推荐手工精子密度分析用Cell-VU计数池为好,CASA分析用Makler计数板。需要注意的是,CASA分析精子密度时,需要人工校正,在保证计算机捕捉的精子数与视野中真实的精子数一致后,再进行分析。

    别外,所有显微镜检查未见精子的精液标本都应离心确定沉渣中有无精子。推荐使用300g离心15分钟后,倾去精浆后将沉渣重悬,彻底检查后未发现精子才能作出无精子症的诊断。

    临床意义:精子密度正常最低为20×106/ml,精子密度<20×106/ml,为少精症;在(5~10)×106/ml之间为中度少精子症;<5×106/ml,为重度少精子症;精液中无精子为无精子症。少精子症和无精子症常见于睾丸生精功能低下、输精管道阻塞或部分阻塞、唯支持细胞综合症等。

(七)精子活力与活动率

      精子活力即精子的运动能力。精子活力的分析有手工和CASA系统分析两种方法。不推荐使用手工方法分析精子活力,而推荐使用CASA系统分析精子活力。因为精子活力的手工分析方法十分不准确。活动精子可能在几秒钟内已从一个视野进入另一个视野。而且,精子活力分析受时间和温度的影响,手工分析时这种影响更大。CASA系统是一种比较客观的分析精子活力的方法,具有较高的精确性。但CASA系统分析精子活力时需进行人工校正,在保证计算机捕捉的精子数与视野中真实的精子数一致后,再进行分析。

    推荐精子活力分类标准:精子活力分为a、b、c、d四级:

    a级:快速前向运动,即37℃时速度≥25 μm/s,或20℃时速度≥20μm/s;25μm大约相当于5个头的长度或半个尾的长度;

    b级:慢速或呆滞的前向运动;

    c级:非前向运动

    d级:不动。

    精子活动率为a+b+c级精子百分率总和。

    可选择精子活力分类标准:精子活力分为a、b、c三级:

a级:前向运动;  

    b级:非前向运动;

    c级:不动。

    精子活动率为a+b级精子百分率总和。

    临床意义:正常生育男性a级精子≥25%,a+b级精子≥50%,精子活动率≥60%。精子活力降低,即a级精子<25%,a+b级精子<50%时,称为弱精子症,病因复杂,最可能与附属性腺或附睾炎症有关。

 

【注】 不推荐的精子活力分类标准:国内一些教科书上将精子活力分为4类:无活动能力、活动能力差、活动能力良好、活动能力很好。无活动能力表示精子无任何活动;活动能力差表示精子前向运动能力差,有的只在原地旋转移动;活动能力良好表示精子呈曲线向前运动;活动能力很好表示精子很活跃地向前呈直线运动。Jenks等将精子活力分为0~Ⅳ级。0无活动精子;Ⅰ精子尾部活动,但不能前向运动;Ⅱ缓慢的波形前向运动;Ⅲ有快速运动,但波形运动的较多;Ⅳ活跃快速前向运动。这样的分类标准比较主观。

(八)精子存活率

    精子存活率以活精子所占百分比表示,可用染色技术确定,一般采用伊红染色法。这是由于死精子的细胞膜受损可透入一定染料,从而使死精子着色而活精子不着色。用光学显微镜计数200个精子,即可得出精子存活率。伊红Y染色法:用生理盐水将伊红配制成5g/L的溶液,将一滴新鲜精液与一滴伊红Y溶液在载玻片上混匀,并覆以盖玻片,30秒后用光学显微镜观察,活精子不着色,死精子被染成红色。

    精子存活率的正常参考值为:≥75%

    临床意义:精子存活率可用以核实精子活力的准确性,精子存活率一般高于精子活动率,因为死精子比例不应超过不动精子的比例。如果活的但不动的精子占很大的比例,应怀疑精子鞭毛结构有缺陷。

(九)精子形态学分析

正常形态精子百分率是评价精子受精能力的重要指标之一。目前,用于精子形态学分析的染色方法有:改良巴氏染色法、苏木精—伊红染色法、瑞氏染色法、瑞吉氏染色法、Diff—Quik染色法和Shorr染色法。6种染色方法对精子头大小的影响不同,瑞—吉氏和瑞氏染色法的精子头的长轴和短轴最低,而HE和Shorr染色法的精子头长长轴和短轴介于巴氏染色法和Diff—Quik染色法之间。6种精子染色方法的染色效果亦不同,Diff—Quik和Shorr染色法可以很清楚地区分顶体和核,其次是HE染色法,而巴氏、瑞氏和瑞—吉氏染色的精子顶体和核分界不很明显。基于不同染色方法对精子头大小的影响、染色效果以及操作的简易与否,Diff—Quik和Shorr染色法值得推荐。

1、涂片的制备

    一般用新鲜的液化精液或生理盐水洗涤过的精子悬液进行涂片,通常每份标本涂双份片子,以备染色或操作出问题。载玻片应洁净,可用于70%酒精洗涤并干燥后使用;涂片的厚薄应根据精子密度而定,精子密度高者涂片应薄些,而精子密度低者涂片应尽可能厚些。涂片的方法有多种,WHO推荐的方法有拉薄技术和滴管法,拉薄技术即用另一张载玻片的边缘拖拉载玻片上的一滴精液;滴管法即水平持滴管使一滴管沿载玻片的表面展开。由于精液有一定的粘稠度,这两种方法都很难涂成均匀的涂片,可作为可选择性方法使用。

    推荐精子涂片方法:用滴管将一滴精液置于载玻片上,然后从液滴中央向周围循环吸净多余的精液,注意滴管的头要平整,滴管与载玻片垂直,缓慢吸去多余的液体。

    低密度、粘稠的、或充满碎屑的标本,建议先离心去除精浆,沉淀的精子团重新悬浮在适当的体积中,以获得尽可能高的密度,但不应超过80×106/ml。正常精子密度且液化良好的精液标本亦可以洗涤后用精子悬液进行涂片,但离心操作对精子形态学分析有无影响,尚需要进一步验证。

    精子涂片可进行空气干燥并固定。固定程序取决于染色方法。

    2推荐的精子形态学染色法

    2.1  Shorr染色法

    精子涂片空气干燥后,用苏木精染色1—2分钟;流水浸洗后置42℃温水中蓝化5分钟;Shorr染剂染3—5分钟;流水冲洗,晾干后镜检。

    2.2  Diff—Quik染色法

    精子涂片先置于固定液(1.8mg二芳基甲烷加至1L甲醇中而成)中固定5分钟;将玻片直立于吸水纸上以去除多余的液体;将玻片在溶液1(1g氧甲蒽加至1L叠氮钠防腐液中)中染色10秒钟,然后在溶液2(0.625g天蓝A和0.625g亚甲基蓝加至1L缓冲液中)染色5秒钟,各步骤之间均除去多余的液体;在流水中浸洗10—15次以除去多余的染料;将玻片垂直竖立以去除水分,使之完全干燥;油镜下观察。

    3 可选择精子形态学染色法

    3.1 改良巴氏染色法

    在自然干燥的精子涂片上滴加1—2滴巴氏染液,染15分钟即可。流水冲洗后自然晾干,显微镜油镜下观察精子形态。

    3.2 HE染色

    为医院病理科的常用染色方法,操作比较繁琐,对于可以借助病理科染色的医疗单位可以选用此法对精子进行染色。

    3.3 瑞氏和瑞—吉氏染色法

    ①瑞氏染液:取瑞氏染料0.1g放入清洁干燥的研钵中,边加少量帐甲醇边磨至染料完全溶解,加甲醇到60ml,倒入棕色瓶中,室温下放置1周以后即可用。②Giemsa染液:取Giemsa染液0.5g,置于33ml甘油中,60℃水浴2小时,使其溶解,再加入60℃预热的甲醇33ml,混匀后置棕色瓶中,室温下放置数周后方能使用(最好放置半年以上)。③30.1mol/LpH6.9磷酸盐缓冲液:称取NaH2PO4.2H2O1.4g、Na2HPO4.12H2O3.94g,加蒸馏水至100ml。染色时,将单独瑞氏染液或瑞氏∶吉氏(10∶1)混合染液滴加于精子涂片上,静置10秒后,滴加等量pH6.9磷酸盐缓冲液,染色10分钟后自来自来水水冲洗,自然干燥,置于油镜下观察。

    4 精子形态学判断标准

    评估精子形态学的标准有:一般标准,精子头有明显畸形、缺陷或不规则、有空泡,精子颈部和尾部有明显异常,如双尾、断裂、弯折等,正常生育男性精液中正常形态精子比例应大于30%;严格标准,只有头、颈、中段和尾部都正常的精子才正常。精子头的形状必须是椭圆形的。顶体的界限应是清晰的,占头部的40%—70%。中段应细,宽度小于1μm,大约为头部长度的1.5倍,并且在轴线上紧贴头部。胞浆小滴应小于正常头部大小的一半。尾部应是直的、均一的,比中段细,非卷曲的,其长度约为45μm。这个分类标准,要求将所有形态学处于临界状态的精子均列为异常。利用此分类标准,正常生育男性精液中正常形态精子比例应大于15%。

    在评估精子正常形态时,推荐使用严格标准。

【注】 精子形态学观察时,应注意下列精子缺陷的类型:

①头部缺陷:大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、无定形头、有空泡的头(未染色的空泡区域占头部的20%以上)、顶体过小的头(小于头部的40%)、双头以及上述缺陷的任何组合。

②颈部和中段的缺陷:颈部“弯曲”(颈和尾形成的角度大于头部长轴的90%)、中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、异常细的中段(即无线粒体鞘)和上述缺陷的任何组合。

③尾部缺陷:短尾、多尾、发卡形尾、尾部断裂、尾部弯曲(>90度)、尾部宽度不规则、尾部弯曲或上述缺陷的任何组合。

④胞浆小滴大于正常精子头部的一半。此小滴通常位于中段。

5 精子形态学分析中的注意事项

只有带有尾部的可辨认的精子,才考虑进行不同形态精子计数;未成熟精子细胞包括圆形精子细胞阶段,不能作为精子计数。精子头脱落或无精子头的不作为精子计数,无尾精子亦不作为头部缺陷计数,但应分开记录。卷尾的精子可能与精子活力低相关,或提示精子已暴露于低渗透压。偶尔,许多精子可能有特异的结构缺陷,例如,顶体发育失败,导致“小圆头缺陷”或“球形精子症”。

精子形态分析要求在100×的油镜亮视野下进行计数,应系统地选择涂片上多个区域进行形态学的评估。不应评估重叠的精子和头部位于边缘的精子,后者可通过上下调整焦距加以识别。用目镜上的微标尺测量精子的大小是必要的。应至少连续计数200个精子(一次计数200个优于两次计数100个)。当病人的诊断和治疗主要依赖于正常形态精子的百分比时,应计数两次200个精子,以增加准确性。

6 临床意义

精子形态学分析是评价精子质量的重要指标。人工受精或卵细胞质内单精子注射的成功率与正常形态精子百分率密切相关。

(十) 精子凝集

精子凝集是指活动精子以不同方式,如头对头、头对尾、尾对尾或混合型,彼此粘在一起。不同活动精子之间、活动精子与粘液丝之间、非精子细胞成分或细胞碎片等粘在一起,为非特异型凝集而非凝集,这种情况应如实记录。

凝集的存在可能提示,但不足以说明不育是免疫因素引起的。凝集在测定精子活力时评估。精子凝集的类型应当记录,如头对头、尾对尾或混合型。可采用一种半定量的分级方法:从没有凝集到所有可动的精子凝集到一起(+++)。

三  计算机辅助的精液分析

手工精液分析往往带有很大的主观性,不同的技术人员分析的结果有时相差甚远,对精子运动能力的判断缺少严格的量化指标。计算机辅助的精液分析(computer-aided semen analysis , CASA)是80年代发展起来的新技术,现已逐步应用于男科实验室的常规分析。CASA具有客观、高效、高精度的特点,尤其能分析与精子运动能力相关的多种参数。CASA系统识别精子是根据认为设定的大小和灰度来判断的,准确性受精液中细胞成分和非细胞颗粒的影响。计算精子活动率时,精子只有产生了一定的位移,CASA系统才认为是活动精子,而对原地摆动的精子判为不活动精子。CASA系统参数的设置、阈值的设定、视屏取像率等都可以影响最终结果[14] 。因此,使用CASA系统分析精液时,需进行人工校正,计算机捕捉的精子数需与视野中真实的精子数一致。

CASA系统用于分析精子运动能力有一套术语:①轨迹速度(VCL):也称曲线设速度,即精子头部沿其实际行走曲线的运动速度。②平均路径速度(VAP):精子头沿其空间平均轨迹的运动速度,这种平均轨迹是计算机将精子运动的实际轨迹平均后计算出来的。③直线运动速度(VSL):也称前向运动速度,即精子头部直线移动距离的速度。④直线性(LIN):也称线性度,为精子运动曲线的直线分离度,即VSL/VCL。⑤精子侧摆幅度(ALH):即精子头实际运动轨迹对平均路径的侧摆幅度,可以是平均值,也可以是最大值。⑥前向性(STR):也称直线性,计算公式为VSL/VAP,即精子运动平均路径的直线分离度。 ⑦摆动性(WOB):即精子头沿其实际运动轨迹的空间平均路径摆动的尺度,计算公式为VAP/VCL。⑧鞭打频率(BCF):也称摆动频率,即精子头部跨越其平均路径的频率。 ⑨平均移动角度(MAD):即精子头部沿其运动轨迹瞬间转折角度的时间平均值。⑩运动精子密度:每毫升精液中VAP>0μm/s的精子数。这些参数可综合反映精子的运动状况,在评价精子获能和顶体反应中也有一定意义。

     不同厂家不同型号的CASA系统应根据其说明书具体操作。

四  精浆生化指标的检测

目前,我国男科实验室已开展的精浆生化指标主要为α-葡糖苷酶、果糖、酸性磷酸酶和锌,但精浆γ谷氨酰转肽酶的检测可望取代精浆精浆酸性磷酸酶的检测.这些检测的试剂可自行配制,也可购买相应的试剂盒进行检测.

(一)    精浆α-葡糖苷酶测定

1、推荐方法

葡萄糖氧化酶法检测精浆总α-葡糖苷酶活性.检测原理是:麦芽糖含有两个吡喃型葡萄糖残基,由α-1,4-糖苷键相连,经精浆α-葡糖苷酶的作用,水解糖苷键生成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶法可测定其生成量。1单位α-葡糖苷酶定义为每毫升精浆与底物在37℃作用30min产生0.1mg葡萄糖。

所用试剂包括:①醋酸盐缓冲液:0.1mol/L PH5.2。②麦芽糖基质液(56mmol/L):称取麦芽糖100mg,溶于5ml 0.1mol/L醋酸盐缓冲液中,用时新鲜配置。③Tris-HCl缓冲液:0.5mol/L PH7.0。④葡萄糖标准液:5.56mol/L。⑤153.06mmol/L氯化钠溶液。⑥葡萄糖氧化酶测定试剂盒:市场广泛可得。

操作步骤见表一。

 

 

 

 

 

Bp

Rb

Ub

U

S

醋酸酸盐缓冲液(μL)

20

20

153.06mmol/L氯化钠(μL)

10

10

麦芽糖基质液(μL)

20

20

20

葡萄糖标准液(μL)

10

37℃ 5min

精浆(μL)

10

10

37℃ 30min

Tris-HCl缓冲液(ml)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

葡萄糖氧化酶试剂(ml)

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

 

混匀37℃ 15min后,用505nm波长,Bp管调零,读取吸光度值。结果计算:精浆α-1,4-葡糖苷酶活性(U/ml)=(U-Ub-Rb)/(S-Rb)×0.01×2×1/0.01÷0.1。

正常生育男性精浆总α-葡糖苷酶活性参考值35.1~87.7U/ml。

2 可选择方法

  精浆中性α-葡糖苷酶的测定。前列腺分泌的酸性α-葡糖苷酶能够被十二烷基硫酸钠(SDS)选择性抑制,检测过程中加入SDS后,检测出的α-葡糖苷酶活性即为中性α-葡糖苷酶活性。这是WHO推荐的方法,但检测步骤比较繁琐,而且,由于SDS溶液为混浊,很容易形成沉淀,在实际检测中不易操作,国内很少开展此项检测。

3 临床意义及注意事项

  精浆中存在两种α-葡糖苷酶的异构体,其中中性α-葡糖苷酶占80%,仅来源于附睾;酸性α-葡糖苷酶占20%,主要来源于前列腺。精浆总α-葡糖苷酶活性高低可反映附睾分泌功能。精浆检测总α-葡糖苷酶活性应注意三点:①离心速度不同,精浆总α-葡糖苷酶活性有所差异。1000g离心10min后精浆总α-葡糖苷酶水平与3000g离心15min后精浆总α-葡糖苷酶水平有显著性差异(P=0.001)[3]。因此,为保证精浆中不含精子,细胞或非细胞成分,精液离心时的速度不得低于3000g离心15min,只有如此,各实验室之间的检测结果才具有可比性。②精浆总α-葡糖苷酶活性与禁欲时间的长短密切相关[15,16]。禁欲4~5天和禁欲6~7天的结果之间没有显著性差异,而禁欲2~3天的精浆α-葡糖苷酶水平明显降低,禁欲7天以上的精浆α-葡糖苷酶水平明显升高。因此精浆α-葡糖苷酶水平检测的最佳禁欲时间推荐为4~7天。③精浆总α-葡糖苷酶活性的检测应进行质量控制。通常情况下,每批检测中应包括高、低浓度的两种质控品。

(二)    精浆果糖测定

1 推荐方法

    间苯二酚显色法。原理为:果糖与溶于强酸的间苯二酚溶液加热后,产生红色化合物,参比标准品,即可知其含量。所用试剂包括:①果糖标准储存液(500mg/L):50mg果糖加蒸馏水至100 ml。②果糖标准液(50mg/L):取果糖标准储存液1 ml 加蒸馏水至10 ml。③0.175mol/L ZnSO4·7H2O:称取50.2g加蒸馏水至1L。④0.15mol/L Ba(OH)2·8H2O:称取47.3g加蒸馏水至1L。⑤1g/L间苯二酚(雷锁辛):用95%乙醇配制。⑥10 mol/L HCl:于87 ml蒸馏水中加入浓HCl 413 ml。

                  具体操作步骤为:①精浆预处理:取精浆0.1 ml,加蒸馏水2.9 ml,混匀;

加Ba(OH)2(0.15mol/L)0.5ml, ZnSO4 (0.175mol/L) 0.5ml, 混匀;静置5min,离心,取上清液备用。②按表2加入试剂。加完后,90℃水浴10min,流水冷却,490nm波长下,以空白管调零读取吸光度值。③结果计算:果糖(g/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×2。

 

           表2    间苯二酚法测定精浆果糖操作步骤

 

测定管

标准管

空白管

待测上清液 ( ml )

1

果糖标准液  ( ml )

1

蒸馏水( ml )

1

间苯二酚( ml )

1

1

1

HCl ( ml )

3

3

3

 

正常生育男性精浆果糖参考值0.87~3.95 g/L。

 

2  临床意义及注意事项

   精浆果糖浓度的测定可用于评价精囊腺分泌功能。精浆果糖可为精子的运动提供能量。但精囊腺功能紊乱时,精液总量减少,精浆果糖含量降低,进而引起精子活力不足,导致不育。

   精浆果糖检测中应注意四点:①果糖标准液配制后应放置2周后使用,而使用2周后出现吸光度降低时应立即更换新的果糖标准液。研究显示[17],果糖标准液在配制的最初2周内吸光度值变异相对较大,在随后的2周吸光度值趋于稳定,然后快速降低,在10天内从0.30降到0.19。果糖为多羟基酮糖,有不对称炭原子,具有旋光性,在水溶液中有变旋现象,经过大约2周的时间,可能存在的5种异构体达到平衡,比旋光度也达到一个平衡而相对稳定,因而在随后的2周时间内吸光度值相对稳定且变异小。由于水为弱亲核试剂,经过一段时间酮糖转变为醛糖并达到一个平衡[18]。由于间苯而酚与浓盐酸遇酮糖呈红色,遇醛糖呈很浅的颜色,一旦果糖在水溶液中逐渐转变为醛糖,吸光度值将逐渐降低,因而出现了最后10天吸光度值快速降低的情形。②离心速度不同精浆果糖浓度稍有差异。离心速度增加时精浆果糖浓度有升高趋势。可能原因为:离心速度高时,精浆中残余精子密度明显降低,由于精子不含果糖,因而低速离心时精浆残留的精子将占据一定体积,使实际精浆量有所降低,因而浓度有降低趋势。因此,为得到最真实的精浆果糖浓度值,离心速度不得低于3000g离心15min。③精液液化后应立即离心将精子和精浆分离,否则会影响精浆果糖检测结果。这是由于体外活动精子不断消耗果糖,研究显示[17],随着精液放置时间延长,精浆果糖浓度逐渐降低。精液放置2h后离心所得精浆果糖浓度比立即离心时精浆果糖浓度显著降低,放置4h比2h又显著降低,而且,此种降低与活动精子密度呈显著正相关(r=0.374,p=0.009)。④精浆果糖测定中应引入质量控制体系[19,20]。对每批标本的测试都应该带有高、低浓度的两种质控品。

 

 

(三)    精浆酸性磷酸酶测定

   1 推荐方法

 磷酸苯二钠法。检测原理为:精浆酸性磷酸酶在酸性条件下分解磷酸苯二钠产生游离酚和磷酸,酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化成红色醌的衍生物,根据红色深浅测出酶活力的高低。所用试剂包括:①0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH 4.9):枸橼酸钠(C6H8O7·H2O) 42g,溶于600ml水中,用NaHO矫正PH值至4.9,加蒸馏水至1L。加氯仿数滴,冰箱保存。②0.01mol/L磷酸苯二钠基质液,取无水磷酸苯二钠2.18g(如含2分子结晶水应加2.54g),加蒸馏水至1L。此溶液应迅速煮沸,以消灭微生物,冷却后加氯仿4ml防腐,冰箱保存(一次不宜配过多)。③碱性溶液:碳酸氢钠4.2g,4-氨基安替比林0.1g,溶于100ml蒸馏水中,加入0.5mol/L NaHO 100ml,混匀。④铁氰化钾溶液:分别称取铁氰化钾2.5g,硼酸17g,各溶于400ml蒸馏水中,二液混合,加水至1L,棕色瓶暗处保存。⑤酚标准储贮存液(1mg/L):称取酚(AR)1g于1mol/L HCl中,用0.1mol/L HCl稀释到1L。

具体操作步骤为:①标准曲线的制备:按表3操作,加完试剂后,立即充分混匀,用510nm波长,0号管调零,读取吸光度值,以1~5管所得读数与其相应的酸性磷酸酶单位(依次为100、200、300、400、500U)回归绘制标准曲线。②将精浆用等渗盐水稀释1000倍后按表4操作。加完试剂后混匀,于510nm波长,蒸馏水调零后读取吸光度。③结果计算:以测定管吸光度-对照管吸光度之差值,查标准曲线求酶活力。1单位酸性磷酸酶定义为每毫升精浆在37℃与基质作用15分钟,产生10 mg酚。

正常生育男性精浆酸性磷酸酶活性为48.8~208.6 U/ml。

 

表3  酸性磷酸酶标准曲线建立步骤

管号

 

0

1

2

3

4

5

酚标准液(ml)

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

蒸馏水(ml)

0.51

0.50

0.49

0.48

0.47

0.46

枸橼酸缓冲液(ml)

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

0.50

37℃水浴5min

碱性溶液(ml)

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

铁氰化钾液(ml)

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

 

表4  酸性磷酸酶操作步骤

 

测定管

对照管

稀释精浆(ml)

0.01

枸橼酸缓冲液(ml)

0.5

0.5

37℃水浴5min

预温至37℃基质液

0.5

0.5

混匀,37℃水浴15min

碱性溶液(ml)

1.0

1.0

铁氰化钾溶液(ml)

1.5

1.5

稀释精浆(ml)

0.01

 

   2 临床意义及注意事项

   精浆酸性磷酸酶活性高低可以反映前列腺的分泌功能。前列腺炎时精浆酸性磷酸酶活性降低;前列腺癌时精浆酸性磷酸酶活性升高。

除标准曲线法检测精浆酸性磷酸酶活性外,试剂盒法亦可检测精浆酸性磷酸酶活性,这是利用检测血酸性磷酸酶试剂盒的方法加以改进而成的[21]。首先将精浆标本作1:10 000稀释,即5μl精浆加入495μl生理盐水,充分混匀后再吸取5μl加入495μl生理盐水,再次充分混匀后,取50μl稀释精浆按试剂盒说明书进行。ACP活性(U/ml)=测定管吸光度/标准管吸光度×10,其定义为:1ml精浆与基质在37℃条件下作用30min产生100mg酚为一个活力单位。与标准曲线法相比,试剂盒法有一定优势。由于标准曲线不可能在每次检测时都制备,而往往是发现检测结果差异较大或者是更换试剂时才重新制备,这常常需经历相当一段时间。然而,在这一段时期内的每次检测过程中,由于样本制备、吸样、孵育、比色等条件的不同,每次检测的吸光度并不能真正代表所测得的精浆ACP活性。而试剂盒法的每次检测中均带有标准品,标准品可以和常规标本同时检测,并且可根据标准品的吸光度直接求出样本的ACP活性值,从而避免了标准曲线法中根据标准曲线查得ACP活性所带来的不足。而且,试剂盒法的批间CV  (分别为13.8%和15.49%)明显低于标准曲线法检测的批间CV(分别24.43%和21.04% )。

精浆酸性磷酸酶检测中应注意三点[22]:①精浆稀释后需立即检测。因为,无论是标准曲线法还是试剂盒方法,精浆稀释后放置30min后的ACP活性均明显低于精浆稀释后立即检测的ACP活性。而且,由于标本稀释倍数较大,应确保充分混匀。②离心速度对精浆酸性磷酸酶检测结果可能有影响。虽然3000g离心15min后精浆ACP活性与1000g离心10min后精浆ACP活性没有显著性差异,但却有增高的趋势。因此,要想得到“单纯”的精浆,离心速度不得低于3000g离心15min。③精浆酸性磷酸酶测定中应引入质量控制体系。对每批标本的测试都应该带有高、低浓度的两种质控品。

 

【注】可选择的评价前列腺功能的指标

              精浆γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)测定

精浆含量是血清的200~500倍,因其稀释倍数远低于酸性磷酸酶,故检测误差比酸性磷酸酶检测为低。与酸性磷酸酶检测一样,γ-GT检测也可分为标准曲线法和试剂盒法,两者检测原理一样,均为:精浆γ-GT可分解γ-谷氨酰-α-萘酚为游离的α-萘酚,α-萘酚与重氮试剂作用产生红色,其色泽浅淡与酶活性成正比。

标准曲线法使用的试剂包括:①硼酸盐缓冲液(PH9.0):硼酸钠3.092g,氯化钾3.728g,溶于500ml蒸馏水中,加1mol/L NaOH 21.4ml,加水至1L。②基质缓冲液(10μmol/L):取γ-谷氨酰-α-萘酚27.1mg,加PH9.0硼酸缓冲液10ml,加热助溶,注意加热时间不要过长。溶解后即置冷水中冷却,防止基质分解,冰箱保存,可用2周。③重氮试剂:临用时取甲液96ml加乙液4ml混合。甲液:氨基苯磺酸 2g ,溶于400ml水中加热,冷却后加冰乙酸200ml,再加水稀释至1L。乙液:亚硝酸钠0.1g溶于100ml水中,约可用1周。④α-萘胺标准液(2μmol/L):取α-萘胺143mg,溶于无水乙醇10ml中,加水至500ml,临用前配置。

具体操作步骤是:①γ-GT标准曲线的制备:取α-萘胺标准液(2μmol/L)以蒸馏水稀释成每毫升含0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol的标准液,按表5分别加入管中,每管0.25ml。试剂加完后,混匀,10min后,用520nm波长以0号管调零读取吸光度值,与其相应的γ-GT单位(依次为25,50,100,150,200,250U)绘制标准曲线。②精浆用生理盐水稀释10倍后按表6操作。试剂加完后,混匀,10min后,于520nm波长用蒸馏水调零读取吸光度值。③结果计算:以测定管吸光度值-空白管吸光度值的差值查标准曲线,即可得γ-GT活力。1Uγ-GT定义为每毫升精浆在37℃与基质作用30min,释出α-萘胺0.5μmol。

正常生育男性精浆γ-GT活性为69.3~206.5U/ml。

 

表5 γ-GT标准曲线的制备

 

0

1

2

3

4

5

6

标准液(ml)

0

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

蒸馏水(ml)

0.26

0.01

0.01

0.01

0.01

0.01

0.01

重氮试剂(ml)

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

 

表6 精浆γ-GT检测程序

 

测定管

空白管

稀释精浆(ml)

0.01

-—

基质液(预温37℃)(ml)

0.25

0.25

  37℃水浴30min

重氮试剂(ml)

5.0

5.0

稀释精浆(ml)

0.01

 

试剂盒法检测精浆γ-GT活性是利用检测血γ-GT活性试剂盒的方法加以改进而成的。每批检测都带有标准品。即取5μl精浆,加入到995μl生理盐水中,充分混匀后吸取50μl加到0.5ml底物基质液中,37℃水浴15min,加显色剂5ml,混匀后静置5min,在530nm波长处测定A值。精浆中γ-GT活力(U/ml)=(测定管A值-空白管A值)/( 标准管A值-空白管A值)×30,其定义为:1ml精浆与基质在37℃作用15min释放出1μmolα-萘胺为一个单位。

试剂盒方法的每次检测中均带有标准品,标准品可以和常规标本同时检测,并且可根据标准品的吸光度直接求出样本的γ-GT活性值,从而避免了标准曲线法查得γ-GT活性所带来的不足。而标准曲线不可能在每次检测时都制备,而往往是发现检测结果差异较大或者是更换试剂时才重新制备,这常常需经历相当一段时间。然而,在这一段时期内的每次检测过程中,由于样本制备、吸样、孵育、比色等条件的不同,每次检测的吸光度并不能真正代表所测得的精浆γ-GT活性。因此试剂盒法略优于标准曲线法[23]

精浆γ-GT检测中应注意三点[24]:①精浆稀释后需立即检测。因为,无论是标准曲线法还是试剂盒方法,精浆稀释后放置30min后的γ-GT活性均明显低于精浆稀释后立即检测的γ-GT活性。而且,由于标本稀释倍数较大,应确保充分混匀。②离心速度对精浆γ-GT检测结果有影响。3000g离心15min后精浆γ-GT活性显著高于1000g离心10min后精浆γ-GT活性,不同速度离心后精浆中γ-GT活性的差异可能与精浆中残存的精子,细胞或非细胞成分有关。因此,为了使各实验室之间的检测结果具有可比性,离心速度不得低于3000g离心15min。③精浆γ-GT测定中应引入质量控制体系。对每批标本的测试都应该带有高、低浓度的两种质控品。

 

(四)    精浆锌的测定

测定体液中锌含量的一种比色分析方法适用于精浆中锌浓度的检测。已有测定精浆中锌浓度的试剂盒出售。

精浆锌的正常参考值为0.8~2.5mmom/l。

精浆锌的测定可用于评价前列腺的分泌功能。

 

五   精液生精细胞检测

1 检测方法

精子涂片:液化精液3000g离心15分钟后,将上层精浆倒出,沉淀用生理盐水悬浮洗涤1~2次后,用生理盐水将精子调整到一定浓度后(约50×109/L)涂片,自然干燥或用电吹风吹干。少精子症和无精子症标本可直接用沉淀涂片,无需用生理盐水洗涤。

染色;瑞-吉氏染色法,改良巴氏染色法和HE染色法均可。具体操作参见精子形态学分析一节。

结果判读:根据细胞核的形态和大小,染色质固缩程度以及核浆比例可将生精细胞分为四种:精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞。在精液中除可观察到正常形态特征的生精细胞外,还可观察到异常生精细胞。

【注】正常生精细胞的特征:①精原细胞:可分为3种类型(Ad、Ap及B), Ad型(暗A型)精原细胞的核圆形或椭圆形,核内有许多细小染色质颗粒,可被铁苏木素深染。核中央有一块苍白区,不被染色。核膜内表面有半球状核仁,通常1~2个,大小不一,嗜伊红。胞质内常出现空泡,富含糖原颗粒,过碘酸反应呈强阳性。Ap型(亮A型)细胞核呈卵圆形,核内染色质颗粒较大,不易被铁苏木素着色。核膜处有1~3个核仁,嗜伊红。与Ad型细胞明显不同的是胞质内糖原颗粒极少,过碘酸反应呈阴性。B型精原细胞核较大,圆形,染色质颗粒着色很浅,但有时出现一些小片状或颗粒状的染色质,染色较深,且部分常附着于核膜上,有时附着于核仁。胞质内无糖原颗粒存在。Ad、Ap型精原细胞一般不易离开基膜脱落,精液中见到的常是B型精原细胞。B型精原细胞是对放射线最敏感的细胞。②初级精母细胞:这一类型的生精停滞出现在第一次减数分裂前期的末尾。精液中可见到偶线期的联会(同源染色体配对)或晚粗线期的去联会(配对的同源染色体片断提前分离)细胞形态。细胞体积较大,直径15~24μm。③次级精母细胞:由初级精母细胞增殖分化而来。体积一般较初级精母细胞小,有单核及双核两种类型,双核形的细胞与蜻蜓的头眼相似。胞核染紫红色。次级精母细胞存在的时间很短,故切片中少见。④精子细胞:由次级精母细胞发育成熟而来。精子细胞变态成精子的过程包括8个不同阶段。精子细胞形态多样,核较小,着色较深,常呈球形或精子头的雏形。

异常生精细胞主要表现在:①胞核变性:这是异常生精细胞的主要特征。

由于胞核受损,分化不良,瑞—吉氏染色呈深紫色,可见到核固缩、溶解和核断裂,可见胞核呈断裂状或为几个核碎片,明显可见着色深浅分明的断裂块。②胞质破损:胞体变形肿大或缩小,甚至破碎,形态多样异常,胞质内空泡大小不一,着色深浅不一。常见有深紫色大小不一的颗粒,有时核裸露,偶见精子穿入生精细胞的胞质内。③核分裂异常:生精细胞核分裂异常,可见有核内复制现象。在次级精母细胞、精子细胞阶段,有时可见三个或四个以上的核,有时可见核浆发育不平衡的生精细胞,核浆比例失调。

 

2 临床意义

精液中生精细胞检查是评价男性生育能力的重要指标[25]。①精液中生精细胞的检查能有效的与精液中其他细胞(如白细胞)区别,避免误诊。②精液中生精细胞的检查结合精浆生化指标的测定可鉴别阻塞性无精子症和非阻塞性无精子症,并可反映睾丸的生精功能。③精液生精细胞检查可取代睾丸活检。采用睾丸活检观察生精细胞形态学,不仅给患者带来痛苦,而且易使患者体内产生抗精子抗体。④可了解细胞毒类药物、温度等因素对生精细胞的影响。⑤动态观察精液生精细胞的变化,可作为男性不育症疗效观察和判断预后的指标之一。

 

六  精液中白细胞的检测

1 推荐方法

联苯胺染色法。所用试剂包括:①125mg联苯胺溶于50ml 95%的甲醇中;②将150mg玫瑰红B溶于50ml蒸馏水中。上述两液混合,取1ml混合液,再加0.3%H2O2 2滴,即为联苯胺染液。具体操作步骤为:取新鲜精液1滴于载玻片上,加入1滴联苯胺染液,混匀,置盖玻片后,于37℃放置20分钟,镜检。白细胞被染成褐色,其他细胞被染成品红色。

2 可选择方法

2.1 正甲苯胺蓝过氧化物酶染色法  所用试剂包括:①饱和NH4Cl溶液(250g/L);②Na2EDTA磷酸盐缓冲液(PH6.0,50g/L);③正甲苯胺蓝(0.25mg/ml) (有致癌作用);④30% H2O2 ,用蒸馏水配制。将试剂1、2、3按1:1:9 (ml)混合后,加入1滴试剂4混合,即为工作液。配制后可使用24小时。具体操作步骤为:①将0.1ml精液与0.9ml上述工作液混合,振荡2分钟;②室温放置20~30分钟,再振荡;③镜检:过氧化物酶阳性细胞染成棕色,过氧化物酶阴性细胞不着色。需要注意的是,这种技术不能检测已经活化并已释放其颗粒的多形核白细胞,也不能检测不含过氧化物酶的其他类的白细胞,例如淋巴细胞。

2.2  CD45单克隆抗体法  人白细胞的所有类型表达一种特异性抗原CD45,故可用抗CD45单克隆抗体来检测不同类型的白细胞,如巨噬细胞、中性粒细胞、B或T细胞等。具体操作可参见相关文献[4]

2.3  CD4、CD8单克隆抗体染色法  人白细胞表面含有特异性抗原CD4、CD8,因此,可用鼠抗人CD4、CD8单克隆抗体来检测不同类型的白细胞,如T细胞或B细胞。具体操作可参见相关文献[4]

3  临床意义

使用联苯胺染色法检测精液中白细胞,可以避免将精液中非精子细胞误认为白细胞。正常精液中白细胞数目不应超过1×106/ml。精液中过多的白细胞(白细胞精子症)可能与感染和精液质量差有关。当精液中白细胞数目多时,应该进行微生物学试验以证实有无附属性腺感染,然而,无白细胞不能排除附属性腺感染。

 

七 精子顶体完整率分析

   1 推荐方法

   精子顶体完整率的分析需要对精子进行涂片和染色,具体方法参见精子形态学分析一节。

   根据顶体的外形和损伤情况,将精子顶体分为4种类型。Ⅰ型:顶体完整,精子形态正常,着色均匀,顶体边缘整齐,有时可见清晰的赤道板。

Ⅱ型:顶体轻微膨胀,精子质膜(顶体膜)疏松膨大。Ⅲ型:顶体破坏,精子质膜严重膨胀破坏,着色浅,边缘不整齐。Ⅳ型:顶体全部脱落,精子核裸露。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型均为顶体不完整精子,计算顶体完整率时一般计数200条精子,计算Ⅰ型顶体精子占计数总精子的百分比。

顶体完整率(%)=顶体完整精子数/精子总数×100%

正常生育男性顶体完整率的正常参考值为:>75%。

2. 临床意义

精子顶体内含有多种水解酶、如顶体蛋白酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶等。在受精时,精子释放顶体酶,分解卵子外周的放射冠与透明带,进入卵子内。顶体酶也能降低宫颈黏液的黏度,提高精子穿透宫颈黏液的能力。精子顶体缺陷与男性不育有密切关系。

 

   八. 精子功能检测

精子功能指标的测定,应该更能客观地反映精子的受精能力,是对精液常规检查的必要补充。目前,除了精子膜功能测定在临床上有一定应用外,其他许多指标的检测因影响因数很多,没有可供临床医生参考的正常参考值范围,在临床实践中很难实施,这些方法目前多用于科研中。

1.    推荐项目:精子膜功能测定

精子膜上含有丰富的多聚不饱和脂肪酸及多种蛋白成分,精子膜的功能与精子获能,顶体反应及精卵融合密切相关。精子膜功能的测定,可预见精子的受精能力。检测精子膜功能常用精子尾部低渗肿胀试验伊红Y水试验。

①  精子尾部低渗肿胀试验(hypo-osmotic swelling test,HOST):精子在低渗溶液中,必须重新建立内外液体间的平衡,水分子通过精子膜进入精子膜进入精子,使精子体积增大而膨胀,这是活精子膜功能正常的标志。而膜功能不全(包括死精子)的精子表现为不膨胀。所用试剂包括:①低渗肿胀液:枸橼酸钠(Na3CH5O7.2H2O)7.35g,果糖13.51g,加蒸馏水至1000ml,4℃冰箱保存。②伊红Y溶液:称取5g伊红Y,溶解于100ml0.01mol/L PH7.4 PBS缓冲溶液中。具体操作步骤为:取液化精液0.1ml,加37℃浴温的低渗肿胀试剂0.85ml,混匀,置37℃水浴30min 后再加入伊红Y溶液0.05ml ,混匀,室温放置2min 。镜下计数200条精子中b~g 型精子的百分率(肿胀精子分为b~g共6种类型,见图6)。b~g型精子尾部呈不同程度的肿胀,g型精子整个尾部肿大呈球状,证明精子膜无损伤,精子功能良好。

②  伊红Y水试验:除可检测精子尾部肿胀率来反映精子膜功能的完整性外,还可以通过检测精子的头部未着色率来评估精子头部膜结构的完整性。所用试剂:50g/L伊红Y水溶液,即伊红Y5g加蒸馏水至100ml。具体操作步骤为:液化精液10μl加伊红Y水溶液40μl,载玻片上混匀,盖上盖玻片,静止1~2min 后置于40×物镜下观察,计数精子尾部总肿胀率和精子头部未着色率。

低渗肿胀率正常参考值:≥70%。

 

值得注意的是,由于某些精液标本在置于HOST 溶液前会出现尾部卷曲的精子,因此有必要在放置于HOST 溶液前观察射精液。处理后获得的尾部卷曲的精子的百分比减去未处理标本中尾部卷曲的精子的百分比,即可以得到HOST 试验中出现反应的精子的实际百分比。

 HOST 试验中的质量控制主要体现对新 HOST 溶液的保证。在临床使用前,应当用老批号的 HOST 溶液对新批号的 HOST 溶液进行校验,评分不应有显著差异。如果差异显著,应废弃该批试剂,重新配制。

若以蒸馏水作为低渗肿胀液,肿胀精子以‘g’形为主,而低渗肿胀液以‘b ’和‘f’形为主。可能由于两者的低渗程度不同,肿胀程度也有所差异。用蒸馏水作为低渗肿胀液,充池于精子计数池中,可同时测定精子密度和精子尾部低渗肿胀率。

2.    可选择项目

2.1 精子穿卵试验   是精子穿透去透明带金黄仓鼠卵试验(Sperm penetration of zona free hamster egg assay,SPA)的简称,首先由Yanagamashi 等于1976 年报道,是测定精子获能、顶体反应、精子卵膜融合能力以及精子核解聚能力以及精子核解聚能力的经典方法。但由于实验条件要求很高,操作步骤多,有一定的技术难度,国内仅限于研究机构用于科研目的,临床未作常规展开。

2.2  精子-宫颈黏液相互作用试验    分体内试验和体外试验。体内试验即性交后试验(Post –coital,PCT)。体外试验主要包括玻片试验和毛细管穿透试验。通常,当性交后试验结果为异常时才进行体外试验,并且使用供者的精液和供者的宫颈黏液进行交叉试验可以提供更多的信息。PCT 结果取决于精子与宫颈黏液的相互作用,任何一方的异常均可影响PCT 结果。宫颈黏液的性状,内分泌失调、PH 宫颈黏液中的白细胞及细胞碎片、宫颈疾病及男女双方性功能障碍等,均可影响 PCT 结果。由于影响因素多,PCT 结果常需复查。

 九   抗精子抗体的检测

测定抗精子抗体的方法报道的很多,目前临床上以ELISA 法为主,少数单位使用了免疫珠试验和混合抗球蛋白反应试验(MAR)。这三种方法可根据医院患者量的多少和能够选用的试剂盒质量而选择使用。

1.  酶联免疫吸附法 (ELISA)

可以同时检测大量标本。检测原理:采用纯化的人精子膜抗原包被微孔,待测标本中的AsAb 与微孔板上的精子膜抗原反应,再与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG结合,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,加入底物溶液,通过显色深浅来判断AsAb 的存在和含量。目前,抗精子抗体ELISA 检测试剂盒可以购得。

具体操作步骤为:①将已包被的微孔板及所有检测试剂置于室温下平衡30min ,同时配制标本稀释液(含5%小牛血清的PBS-T)。②根据不同待测标本,每孔加标本稀释液100μl 或50μl ,阴、阳性对照不加,空白对照孔加100μl 标本稀释液。③依次加入标本(血清20μl,精浆和宫颈黏液50μl)和100μl阴、阳性对照。④37℃温育40分钟。⑤用PBS-T 洗板4次,每次3min,拍干。⑥每孔加酶结合物2滴,充分混匀,用封膜覆盖,置37℃温育30min 。⑦甩净孔内液体,加洗液,洗涤方法同上。⑧每孔加显色液A、B各1滴,混匀后避光反应10min。⑨每孔加终止液1滴,混匀后避光反应10 min 。⑩以空白孔调零,450 nm测吸光度值,P/N≥2.1为阳性,也可以直接肉眼判断(与阳性对照比较)。

目前,市场上有不少厂家提供抗精子抗体检测试剂盒,但检测结果差异较大。因此,临床医生应慎重看待抗精子抗体检测结果。

2.  免疫珠试验

采用包被羊抗人IgG、IgA的亲水性聚丙烯酰胺珠(免疫珠)来检测精子表面结合抗体,或待测血清(宫颈黏液)中的抗精子抗体。忑分为直接法和间接法。直接法检测精子表面结合抗体,具体操作步骤为:①新鲜待测精液1滴,一式3份,分别加1 滴最适稀释度的羊抗人IgG、IgA 、IgM 包被的免疫珠悬液,混匀后加盖玻片。②置湿盒1h ,然后在光学显微镜下观察。间接法检测精浆、血清或宫颈黏液中各1g 类别的抗精子抗体。具体操作步骤为:①生育男性提供的精液(活率>70%以

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发表于:2013-07-31 23:26

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