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头颈部肿瘤的DNA定量分析

发表者:汪涛 2186人已读

汪涛 黄红彦  崔永华  孙小蓉 刘秋润  高启学

细胞学用于肿瘤诊断历史以久,常规细胞学检查由于取材、制片等环节因素的影响,往往使其检出率不高,临床应用亦受到限制。随着计算机相关的定量技术的发展,细胞学领域也开始了由传统的细胞诊断逐步向核内DNA定量和核形态定量研究方向发展。定量细胞学研究的标准数字化,使诊断更客观性。作者应用目前国际上先进的全自动细胞图像分析仪对头颈部肿瘤细胞进行DNA定量分析,及细胞周期分析。以探讨细胞定量在头颈部肿瘤诊断中的意义,并试图找出与恶性肿瘤相关的定量学指标,为肿瘤的早期诊断提供客观的临床依据。上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻喉科汪涛

1、         材料和方法

  1.1 临床资料

取自2002.7-2003.1同济医院耳鼻咽喉科,病理均确诊的头颈部恶性肿瘤病例23例(其中喉部鳞状细胞癌21例、上颌窦鳞状细胞癌1例和上颌窦腺癌1例)和良性病变20例(喉结核1例、鼻腔毛细血管瘤1例、喉乳头状瘤2例、喉淀粉样瘤1例、声带息肉10例和声带囊肿5例)。23例恶性肿瘤病人中除1例未行手术治疗,按国际抗癌协会TNM分类标准(1997)第5版,Ⅰ期3例、Ⅱ期13例、Ⅲ期7例。

  1.2 检测方法

标本取材均采用瑞典产细胞刷(CytoBrush),以方便准确取到取材部位上皮层的脱落细胞,途径:①活体取材在支撑喉镜直视(喉部)或窥鼻器(鼻部)直视下,刷取病变局部细胞学标本,置于装有SED-FIX液标本收集管中保存;②恶性肿瘤手术标本在直视下按肿瘤部位、瘤旁1cm和手术切缘(>1cm)三个部位分别刷取细胞学标本,取材的标本分别置于装有SED-FIX液的3个标本收集管中保存。细胞标本处理:按液基薄层制片(ThinPrepR),加入适量粘液消化液,振荡、解聚、离心、纯化、浓缩标本液后,于细胞涂片离心机(CytoSpin)上薄层制片两张,细胞均匀分布于玻片上直径约6mm的圆形区域,自然风干。一张巴氏染色作细胞常规诊断,一张Feulgan染色,送高分辨率全自动细胞图像分析仪(Cyto-Savant System)扫描分析(灰度级为1000,每张玻片由分析仪自动随机选取2000个以上细胞作为基数,每个细胞核经扫描后均有123个参数)。

1.3 分析

1.3.1  以正常二倍体细胞(淋巴细胞,DNA定量为2c)的细胞核平均DNA含量作为内对照确定二倍体峰位置,被测细胞的DNA含量与其比较,得到DNA指数(DI),表示为:

DNA Index  =

被测细胞DNA含量

淋巴细胞核平均DNA含量

根据European Society Analytical Cellular Pathology (ESACP)(1997)标准12,当CV(DI变异系数)<5%时,主峰DI在0.9-1.1之间,为二倍体,1.9~2.1为四倍体;DI<0.9或1.12.1,可认为是异倍体。

1.3.2  细胞周期指标

   S期细胞分数(S-phase Fraction, SPF)表示为:

SPF  =

S

× 100%

G0 / G1 + S + G2 / M

细胞增殖指数(Proliferation Index, PI)表示为:

PI  =

S + G2 / M

× 100%

G0 / G1 + S + G2 / M

  

5c Exceeding Rate(5c Ex)

           表示DI值大于2.5的细胞占总细胞数的百分比

1.4  统计分析

专业统计软件(SAS系统),DNA定量与常规细胞学检测作X2检验、DNA倍体和细胞周期各指标作相关t检验和方差分析。

2、结果

23例恶性头颈部肿瘤活体刷片26张,手术标本分别3部位刷片66张(22例行手术治疗),20例良性病变活体刷片21张,结果显示细胞定量分析和常规细胞检查的阳性率分别为76.92%和50%(表1)。头颈部恶性肿瘤中,异倍体出现率为65.22%,而良性病变中无一例异倍体,但倍体性在恶性肿瘤的临床分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)和病理类型(角化型与非角化型,除外1例腺癌)中未显示有明显统计学意义(表2)。SPF、PI和5c Ex在恶性病变组分别为14.05%、19.59%和1.59%,较良性病变组的3.34%、4.14%和0.03%有明显升高,差异显著。同时,SPF和PI两细胞周期参数提示肿瘤部位的细胞增生程度高,与瘤旁1cm和手术切缘处存在明显不同(表3)。

DNA定量与常规细胞学检测比较(表1)

分  组

DNA定量

阳性率

 

细胞学常规

阳性率

阳 性

可 疑

阴 性

 

阳 性

可 疑

阴 性

恶性组

20

1

5

76.92% *

 

13

3

10

50%

 

良性组

0

4

17

0

 

0

0

21

0

 

注:*标记为有统计学意义(P<0.05)“阳性”表示诊断为恶性病变 “可疑”表示怀疑恶性病变 “阴性”表示诊断为非恶性病变

 

DNA倍体与恶性肿瘤的生物学特性(表2)

分          组

例   数

DNA 倍 体

异 倍 体 率

二 倍 体

异 倍 体

病理类型a

 

 

 

 

角 化 型

14

6

8

0.57

非角化型

8

1

7

0.88

肿瘤部位b

 

 

 

 

声门上型

9

1

8

 0.89 *

声  门型

12

7

5

 0.42 *

恶性肿瘤临床分期

 

 

 

 

Ⅰ    期

3

2

1

0.33

Ⅱ    期

13

4

9

0.69

Ⅲ    期

7

2

5

0.71

注:*标记为有统计学意义(P<0.05)  a 、除外1例腺癌  b 、除外2例上颌窦癌

 

细胞周期指标与肿瘤生物学特性(表3)

分    类

SPF (%)

PI (%)

5c Ex (%)

病变组织

 

 

 

恶      性

 14.05**

 19.59**

1.59*

良      性

3.34

4.14

0.03

手术部位

 

 

 

肿瘤部位

 17.41**

 22.8**

1

瘤旁1cm

2.49

5.94

2

手术切缘

3.51

5.07

0.5

肿瘤临床分期

 

 

 

Ⅰ   期

11.8

12.96

0.17

Ⅱ   期

16.2

22.57

1.16

Ⅲ   期

21.85

30.65

4.13

倍体类型

 

 

 

良      性

3.34

4.14

0.03

二倍体肿瘤

5.61

6.57

0.03

异倍体肿瘤

 23.61**

32.96**

 2.96**

注: *标记为有统计学意义(P<0.05)     **标记为有显著统计学意义(P<0.01)

3、讨论

肿瘤遗传学研究表明,DNA是细胞的遗传物质,是决定细胞生长、分化、分裂和各种形态的重要因素。肿瘤的发生始于单细胞的克隆增生,细胞内染色体数量的改变,其结构的畸变必然反映在其分子基础的DNA含量的变化上,细胞定量分析主要是针对DNA含量的分析。从理论上讲,在恶性肿瘤性疾病细胞学的改变要比组织学的改变发生早,但是常规取材、制片等多方面的因素使得诊断结果不够理想。该实验运用全自动细胞图像分析系统,并加以液基薄层制片技术,使得恶性肿瘤的阳性诊断率提高到76.92%(20/26),较常规细胞学诊断率50%(13/26)有所提高,但细胞定量学诊断的特异性却只有81%(17/21),随着该仪器专家诊断软件的改进,增加新的细胞定量参数,有望提高其诊断特异性。

文献报道34,正常细胞DNA含量呈二倍体分布,恶性肿瘤中DNA为异倍体的肿瘤恶性程度要较二倍体的肿瘤高。本研究亦表明恶性肿瘤异倍体发生率为65.22%,而良性病变者均为二倍体(P<0.0001),提示异倍体的出现可作为诊断头颈部恶性肿瘤的重要指标之一,并且恶性肿瘤中异倍体率随肿瘤病变临床分期增加而有依次增加之趋势,表明恶性程度愈高,则异倍体率可能愈高。有报道56认为DNA异倍体与喉部等头颈部鳞状细胞癌的淋巴结转移和预后相关,该研究中异倍体出现率在角化型和非角化型两种病理类型中虽未显示有差别,但是喉癌中声门上型异倍体率88.89%(8/9)显然高于声门型41.67%(5/12),符合声门上型肿瘤有较高的淋巴转移、预后差等恶性程度较高的生物学特性。

SPF、PI和5c Ex作为细胞周期分析指标,能客观反映细胞的增殖状况,正常组织被覆上皮细胞多处于G0/G1期(DI=1.0左右),少数细胞可处于S期或G2/M期。当组织癌变时,细胞增殖失控,增生期(S、G2、M期)细胞数可明显增多,超过正常范围,甚至出现大量DI>2.5的细胞(DI大于2.5考虑为癌细胞)(见图1),许多文

图 1

献也曾报道7-10较高的SPF、PI与肿瘤的倍体、P16基因突变、恶性度及预后明显有关,并且Biesterfeld S等11证实5c Ex指标在鉴别子宫颈内膜腺癌有较高敏感性。本研究证明5c Ex在恶性肿瘤组织与良性病变组织之间的差异明显(P<0.05),SPF和PI在异倍体肿瘤与二倍体肿瘤和良性病变比较,明显要高(P<0.01),其值在异倍体-二倍体-良性组依次降低,反映了组织恶性度越高,则SPF越大,正常组织内SPF小于10%12,超过此值可考虑肿瘤性增生。可见,SPF、PI和5c Ex是可用于临床辅助鉴别头颈部恶性病变和良性病变的客观定量细胞学指标。SPF和PI在帮助临床医生评估手术安全范围方面也可提供客观依据,实验结果表明肿瘤部位组织细胞增生活跃(SPF=17.41%,PI=22.82%),比瘤旁1cm(SPF=2.49%,PI=5.94%)和手术切缘(SPF=3.51%,PI=5.07%)明显高(P<0.01),而鉴于病例数的限制瘤旁1cm与手术切缘间细胞增生程度未有明显差别,根据结果笔者认为将距肿瘤边缘至少1cm处作为手术切缘较为安全。

实验结果显示全自动细胞图像分析仪的应用与细胞定量分析,使细胞学诊断更客观,诊断阳性率也较常规细胞学检查明显提高,作为临床肿瘤细胞学诊断,不失为一种客观、简便的检查方法。异倍体率、SPF、PI和5c Ex指标对在诊断头颈部肿瘤、估计肿瘤的生物学恶性程度和评估手术范围等临床工作中能提供有价值的定量细胞学依据。

参考文献

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发表于:2010-02-05 20:39

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