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全自动细胞图像分析仪作喉部鳞状细胞癌癌细胞核形态学定量分析

发表者:汪涛 3752人已读

汪涛  黄红彦  崔永华  孙小蓉  刘秋润   

      常规细胞学诊断用于临床诊断历史以久,由于其诊断假阴性率高、诊断主观性强,而使诊断偏差较大。全自动细胞图像分析技术不仅在细胞取材、细胞学制片上的改进,而且使诊断简单化、细胞学特征定量化,使诊断更为客观。文献报道细胞核形态学分析在乳腺癌1、前列腺癌2、肾细胞癌34鼻咽癌5等恶性肿瘤的临床诊断及预后评估方面起着一定辅助价值。本研究仅从细胞形态定量的角度来探讨喉鳞状细胞癌癌细胞核的形态学特征及其与临床的关系,以期为诊断喉部恶性肿瘤提供客观的细胞核形态学指标。上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻喉科汪涛

1、         材料和方法

  1.1 临床资料

      所取83张细胞刷片标本来源于病理确诊为喉部鳞状细胞癌21例(角化型14例和非角化型7例)(每例各3张)和喉部良性病变20例,21例肿瘤病例按国际抗癌协会TNM分类标准(1997)第5版,Ⅰ期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期7例,其中声门上型9例、声门型12例。

   1.2 检测方法

      标本取材采用瑞典产细胞刷(CytoBrush)刷取病变局部(活体标本在支撑喉镜直视下取材;手术离体标本在直视下按肿瘤部位、瘤旁1cm、手术切缘三个不同部位取材),所取细胞学标本于SED-FIX固定液中保存送制片室,按Thin-PrepR(薄层液基制片)制片(文献报道Thin-PrepR制片对细胞核形态并无影响,而且对鳞状上皮病变诊断较常规细胞学涂片好67),送全自动细胞图像分析仪(Cyto-Savant)分析。

      用于该研究的全自动细胞图像分析仪(Cyto-Savant)使用Xillix Micro Imager 1400专业型高分辨率数码相机,装配具有6.8×6.8微米2的成像靶面的Kodak KAF 1400 专业型CCD传感器,其分辨率为1024(垂直)× 1280 (水平)以及Nikon Optiphot II型显微镜(显微镜的成像参数为:每个像素的成像面积为0.34 × 0.34μm2,1微米的成像景深,成像视场面积为440 × 350μm 2),成像细胞核图像特征包括了形态学、光密度、以及纹理等方面的特征参数共126个,DI>2.5的细胞判断为恶性变细胞。

研究选取肿瘤处刷片标本中细胞核DI>2.5的肿瘤细胞核共1269个,对照组选取20例良性病变中G0/G1期细胞组(DI在1.0左右)的细胞核共2000个和M期细胞组(DI在1.9-2.1)的细胞核400个。喉部恶性、良性病变S期细胞形态对比分析,采用DI分组法,从DI为1.1开始,按0.1递增到1.9,分为1.15、1.25、1.35、1.45、1.55、1.65、1.75、1.85共8个组,讨论Area(核面积)、DNA Amount(核DNA含量)随DI变化的情况。

      选择Area、Mean Radius(核平均半径)、Var Radius(核平均半径方差)、Sphericity(核圆球度)、Perimeter(核周长)、DNA/Area(核单位面积DNA的量)等6个参数作为主要形态学定量参数,各参数含义表示如下:

        1

  L    M

∑∑Ωi,j

 i=1   j=1

 

              Area    =

 

          Area表示显微镜下待测细胞核所占的像素的总数,即核面积

        2Mean Radius 表示二维平面上每个细胞核在不同的8个方向上所测的半径的平均值

        3Var Radius 表示每个细胞核所测得8个方向上半径的方差值,反映了细胞核半径的变异度

        4

Sphericity  =

Min( rk )

Max( rk )

               

 

 

          Sphericity 表示细胞核所测得8个方向上半径的最小与最大半径的比值,反映细胞核的圆球度

        5

Compactness  =

P2

4πA

 

          Compactness 为描述细胞核圆度的形态学参数,P代表核周长,A代表核面积

        6

DNA/Area  =

DNA Amount

Area

          

 

 

          DNA Amount 表示待测细胞核在显微镜的光学浓度,粗略反映核内DNA的含量。DNA/Area 则代表细胞核单位面积DNA含量,反映了核的平均面密度

   1.3 分析

      采用专业统计软件(SAS系统),对不同的倍体核组(二倍体核组、四倍体核组和肿瘤核组)、不同的病理类型(角化型与非角化型)、临床分期(Ⅱ期与Ⅲ期)以及肿瘤发生部位(声门型与声门上型)作T-test,二倍体核组与肿瘤细胞核组建立Logistic回归模型,平均半径与核面积作拟合抛物线(拟合方程Y=  aX2 + bX + c)。

2、         结果

2.1         二倍体核、四倍体核与肿瘤细胞核形态参数比较

二倍体核、四倍体核与肿瘤细胞核形态参数比较(表1)

 

二倍体核组        (Mean±SD)

四倍体核组        (Mean±SD)

肿瘤细胞核组      (Mean±SD)

Area (μm2)

66.79±14.78

95.76±26.63

185.48±87.05

Mean Radius (μm)

4.43±0.52

5.35±0.75

7.25±1.73

Var Radius (μm)

0.27±0.24

0.47±0.45

0.49±0.91

DNA/Area

2.33±0.55

3.27±0.86

3.04±1.45

Compactness

1.14±0.05

1.18±0.06

1.20±0.22

Sphericity

0.68±0.10

0.66±0.11

0.72±0.10

Perimeter (μm)

30.47±3.49

37.27±5.12

44.55±11.53

注:除Var Radius的四倍体核组与肿瘤细胞核组无统计学意义外,均有显著意义(P<0.01)

表1结果显示,除Var Radius在四倍体组与肿瘤细胞组无统计学意义,其余各指标Area、Mean Radius、DNA/Area、Perimeter、Sphericity在各组均有显著的统计学意义。

   2.2  核形态参数与肿瘤生物学特性

核 形 态 参 数 与 肿 瘤 生 物 学 特 性 (表2)

 

Area      (X±SD)

Mean Radius(X±SD)

Var Radius(X±SD)

DNA/Area(X±SD)

Perimeter(X±SD)

Sphericity(X±SD)

病 理 类 型

 

 

 

 

 

 

 

角 化 型

140.35±54.50*

6.44±1.28*

0.46±0.43*

3.49±1.42*

44.57±8.79*

0.70±0.09

 

非角化型

117.53±44.93*

5.88±1.14*

0.34±0.34*

4.06±1.54*

40.93±8.02*

0.71±0.08

临 床 分 期

 

 

 

 

 

 

 

Ⅱ   期

131.53±52.45

6.22±1.27

0.41±0.44

3.69±1.61

43.12±8.79

0.70±0.09

 

Ⅲ   期

124.48±48.91

6.06±1.20

0.37±0.33

3.91±1.42

42.06±8.34

0.70±0.07

发 生 部 位

 

 

 

 

 

 

 

声 门 型

146.51±58.81*

6.58±1.33*

0.45±0.38

3.31±1.44

45.54±9.28*

0.70±0.08

 

声 门 上 型

171.00±79.78*

6.93±1.62*

0.50±0.97

3.19±1.57

49.36±12.90*

0.71±0.10

 注:标记有“*”的有显著统计学意义

       表2结果显示喉部角化型鳞状细胞癌与非角化型鳞状细胞癌癌细胞核在Area、Mean Radius、Var Radius、DNA/Area、Perimeter显示有显著差异性(P<0.01),而声门上型肿瘤仅在Area、Mean Radius、Perimeter上较声门型肿瘤显示有差异性,但临床分期Ⅱ、Ⅲ期间各参数无差异。

   2.3  二倍体核组与肿瘤细胞核组建立Logistic回归模型

二倍体核组与肿瘤细胞核组建立Logistic回归模型 (表3)

Parameter

Parameter  Estimate

Standard  Error

P   Value

Intercept

52.0673

34.861

0.1353

Area

0.2636

0.0741

  0.0004 **

DNA  Amount

0.0109

0.0426

0.7973

DNA / Area

-25.3609

12.9628

0.05 *

Mean  Radius

-0.4535

3.9896

0.9095

Var  Radius

2.3099

7.8454

0.7684

Sphericity

2.5968

22.7198

0.909

Compactness

33.4364

29.9817

0.2648

Perimeter

-2.5944

0.97

  0.0075 **

  注:标记为“*”的有统计学意义,标记为“**”的有显著统计学意义

 

      二倍体核组与肿瘤细胞核组Logistic回归分析显示模型有显著统计学意义(P<0.001)(见表3),其中核形态学参数Area(P=0.0004<0.01)、Perimeter(P=0.0075<0.01)和DNA/Area(P=0.05)对于诊断喉部鳞状细胞癌意义较大。

   2.4  喉部恶性、良性病变S期细胞核Area、DNA Amount比较与喉部恶性病变手术不同部位S期细胞核Area、DNA Amount比较

喉部恶性、良性病变S期细胞核Area、DNA Amount比较 (表4)

  DI

 

Area (Mean μm2)

 

DNA Amount (Mean)

 

 

对照组

肿瘤组

 

对照组

肿瘤组

1.15

 

70.55993

77.55835

 

135.6882

150.938

1.25

 

70.3241

85.12668

 

165.6759

169.1145

1.35

 

65.28394

85.70815

 

206.6633

184.7002

1.45

 

62.87022

86.91155

 

216.7355

198.4723

1.55

 

64.32562

88.01322

 

232.0163

204.1949

1.65

 

63.92102

89.74837

 

250.7369

213.0101

1.75

 

65.61109

97.56871

 

265.4538

234.6519

1.85

 

73.28346

109.4304

 

282.4716

248.8002

 

喉部恶性病变手术不同部位S期细胞核Area、DNA Amount比较 (表5)

DI

Area (Mean μm2)

 

DNA Amount (Mean)

 

肿瘤处

旁1cm

切缘处

 

肿瘤处

旁1cm

切缘处

1.15

86.3895

63.5219

57.7653

 

152.5078

154.4166

150.9958

1.25

87.3430

47.9946

45.5450

 

165.4331

165.4344

162.5310

1.35

84.8486

55.5458

46.3284

 

179.5944

160.7990

174.5759

1.45

86.6179

57.4250

49.0917

 

195.7056

192.8191

180.5395

1.55

87.5704

58.1485

56.7631

 

200.7812

216.4054

196.5811

1.65

89.2004

65.0498

61.9002

 

208.7908

228.8481

232.3037

1.75

96.7733

66.8250

76.4570

 

230.2678

240.6228

247.2536

1.85

108.3957

74.6185

78.0483

 

243.7619

257.1833

258.1777

      通过对细胞S期的分组分析(见表4、5),得出喉部鳞状细胞癌组织中S期细胞胞核均在77μm2以上。

   2.5  喉恶性、良性病变细胞核平均半径与核面积作多项式回归分析

喉部恶性、良性病变细胞核面积与核平均半径作多项式回归分析(拟合方程Y=aX2+bX+c) (表6)

 

多项式回归分析系数

相关指数

 

 

a

b

c

DI>2.5细胞

-0.00002

0.0273

2.9936

0.89

 

0.0262-0.0285

2.8664-3.1207

DI=1.0左右细胞

-0.00014

0.0539

1.4924

0.99

 

0.0535-0.0544

1.4784-1.5064

S期细胞(肿瘤组)

-0.00009

0.0458

1.8656

0.85

 

0.0449-0.0467

1.8210-1.9101

S期细胞(对照组)

-0.00011

0.0504

1.6214

0.99

 

0.0500-0.0508

1.6054-1.6373

      平均核半径和核面积作拟合抛物线(拟合方程Y=  aX2 + bX + c),各参数估计见表6,提示b值越小(b<0.045),c值越大(c>1.82),则与肿瘤越相关。

3、         讨论

细胞生物学认为组织中非分裂期细胞可存在于G0/G1期、S期(合成期)、G2期(分裂前期)的不同阶段,正常细胞即使处于G2期,其DNA含量不应大于G0/G1期DNA含量的 2倍。全自动细胞图像分析仪自动诊断DI>2.5的细胞为可疑肿瘤细胞,肿瘤细胞核组Area、Mean Radius、Perimeter分别为185.48±87.05μm2、7.25±1.73μm、44.55±11.53μm,较四倍体核组的95.76±26.63μm2、5.35±0.75μm、37.27±5.12μm和二倍体核组的66.79±14.78μm2、4.43±0.52μm、30.47±3.49μm明显增大,说明喉癌癌细胞核在形态方面表现有较大的核面积、平均核半径、核周长,尤其在核面积增加的同时,癌细胞核的DNA/Area(3.04±1.45)反而比四倍体细胞核组(3.27±0.86)低,说明肿瘤组织中癌细胞细胞核面积的增大与核内遗传物质的增加不成比例性,另外反映细胞核圆球度的形态参数Sphericity在各组中有显著差异(肿瘤核组0.72±0.10,四倍体核组0.66±0.11,二倍体核组0.68±0.10),由此可见肿瘤细胞核有喉部良性病变组织细胞周期中各细胞核不同的核形态特征,以及异常的生物学特性。

不同病理类型肿瘤组织中肿瘤细胞的形态学可明显不同,Tan PH等8认为原位乳腺导管癌(DCIS)随着病理类型从低-中-高分化,其瘤细胞核面积、核周长逐渐增大,Suzuki M 9得出核面积的变异系数与乳腺癌的组织学分级有明显相关,其值越高生存率越低。该研究得出喉部角化型鳞状细胞癌癌细胞核有相对较大的核面积、平均核半径、核周长,较大的Var Radius的反映角化型癌细胞核细胞核变异较大,而核单位面积的DNA含量(DNA/Area=3.49±1.42)却小于非角化型(DNA/Area=4.06±1.54),作者认为非角化型癌细胞核其平均核密度较高,可能代表有较恶性的生物学特性。

声门型和声门上型在发生学上起源不同,发生于声门上的肿瘤有较高的恶性程度,其局部淋巴结转移率高,我们从肿瘤细胞核的形态定量分析也得出在声门上型与声门型肿瘤瘤细胞核单位面积DNA含量无差异的情况下,声门上型表现有大的核面积、平均核半径、核周长的结论,提示核单位面积DNA含量相等时,有较大核面积、平均核半径、核周长的肿瘤细胞恶性度也较高。国外有文献10认为,喉部恶性肿瘤不同临床分期瘤细胞核的形态学指标差异性不同,由于该实验Ⅰ期临床肿瘤的肿瘤细胞数量相对较少,其结果未能显示有差异性。

Logistic回归模型显示有统计意义,其中核形态学参数Area(P=0.0004<0.01)、Perimeter(P=0.0075<0.01)和DNA/Area(P=0.05)对于诊断喉部鳞状细胞癌意义较大,参数估计Area=0.2636、Perimeter=-2.5944、DNA/Area= -25.3609,提示细胞核Area值越大则诊断为恶性细胞的可能性越大,而Perimeter与DNA/Area恰恰相反,是有保护意义的核形态参数。

S期作为细胞周期中遗传物质含量倍增的过渡期,核内DNA、RNA及蛋白质的量都发生着微妙的变化,势必会在核形态上表现出相应的改变。我们通过将S期细胞按DI值均分为8个组分析,目的是能动态地反映出核形态随DNA指数地变化,实验结果认为喉部恶性肿瘤组织中S期细胞胞核均在77μm2以上,较良性病变组明显高(P<0.001),由图1、2可见DI的增加核面积依次增大,而良性病变组核面积增大不明显,但两者的DNA Amount均随DI增加而增大,

 

图1                                         图2

无明显差异。同样我们选取手术不同取材部位标本做以上分析,也得出肿瘤部位取材的S期细胞胞核面积比瘤旁1cm和手术切缘处取材的明显增大(P<0.001)(图3、4),DNA Amount在三组中未见明显差异,均随DI的增加而增大,说明肿瘤组织中不仅DI>2.5的肿瘤细胞有明显异常的核形态学特征,而且细胞周期中的S期就表现出了较大的细胞核特征,尤其对于早期肿瘤和不出现DI>2.5的异倍体细胞的二倍体肿瘤的诊断意义可能较大,但需进一步的研究来证实。

 

                     图3                                            图4

Kirillov VA等11对甲状腺良、恶性病变的细胞核周长和核面积作二项式回归分析(拟合抛物线),得出一次项系数越小,常数项系数越大则与肿瘤组织越相关。我们选择良性对照组DI=1.0左右细胞、良性对照组S期细胞、肿瘤组S期细胞和肿瘤组DI>2.5的瘤细胞分为四组,分别对平均核半径和核面积作拟合抛物线(拟合方程Y=  aX2 + bX + c)。结果显示四组抛物线拟合相关性均较好,但两肿瘤组拟合相关性稍低,结合分析图5、6、7、8,由于大量细胞偏离曲线所致,尤其在肿瘤组S期细胞组表现更为明显,从而说明了肿瘤组织中细胞核面积随平均半径的增大,表现为不均衡性,说明了其中细胞核形态的不规则和多样。

 

                    图 5                                          图 6

 

图 7                                          图 8

拟合抛物线参数估计得出四组方程分别为:

Y=  -0.00014X2 + 0.0539X + 1.4924

Y=  -0.00011X2 + 0.0504X + 1.6214

Y=  -0.00009X2 + 0.0458X + 1.8656

Y=  -0.00002X2 + 0.0273X + 2.9936

其一次项系数b依次减小而常数项系数则依次增大,并且95%可信区间均无重叠(见表6),可以看出正常静止期(DI=1.0左右)细胞、正常增生期(S期)细胞、肿瘤增生期(S期)细胞、肿瘤细胞(DI>2.5),在平均半径与核面积的拟合抛物线中,b值越小(b<0.045),c值越大(c>1.82),则越能说明是肿瘤性来源。作者认为平均半径与核面积的抛物线拟合中的二项式方程系数不失为又一种诊断喉部恶性肿瘤的客观定量学指标,尤其在联合形态学参数(Area、Mean Radius、DNA/Area、Perimeter)、S期细胞核面积对于辅助细胞学诊断喉部鳞状细胞癌价值更大,并且结合临床综合评价肿瘤的生物学特性及恶性程度。 

        

参考文献

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发表于:2010-02-05 20:45

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