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医学科普

第一例使用转基因细胞再生人体全身皮肤深度解读——转 (转载)

发表者:林志淼 人已读

本文转自上海蝴蝶宝贝关爱协会总理事周迎春先生,已获得授权。

第一例使用转基因细胞再生人体全身皮肤深度解读

2017年11月9日,很多网站转载的一则消息引起了蝴蝶宝贝们的极大关注。新浪的消息是:《罕见皮肤遗传病被攻克:7岁儿童通过干细胞基因疗法重获表皮》。文中提到德国波鸿鲁尔大学儿童医院为一名患有交界型大疱性表皮松解症(JEB)的7岁患儿实施了表皮干细胞基因疗法。患者在2015年6月入院,到2016年2月手术完成出院。北京时间11月9日凌晨,国际学术期刊《自然》(Nature)在线发表了这项由Michele De Luca等多名意大利和德国研究人员共同完成的治疗。北京大学第一医院皮肤性病科林志淼

这位患者的病因是编码层粘连蛋白332的基因之一LAMB3发生了突变,导致表皮和真皮很容易脱离,进而产生水疱和糜烂。这位患者因感染和皮肤大面积破损入院,五周后皮损扩大,濒临死亡。此时患者父亲要求尝试试验性的措施,德国医生和曾经做过小面积表皮基因改造和移植的意大利医生联系,共同为患儿做了基因治疗。治疗的方法是:从患者身上取一块儿皮肤,分离出皮肤干细胞,导入正常的基因后,体外培养成皮片,最终将再生皮肤移植回患者身上。

“表皮目前稳定健康,和真皮连接完好,能抵抗外力损伤。没有出现水疱、瘙痒等症状,也无需药膏或药物治疗。”

看到上述消息后我查找了论文和其它报道,下面就把事件的全貌呈现出来。

1. 手术过程

患者叫Hassan,中文翻译成“哈桑”吧。他出生在叙利亚,一周后发现背上有水疱。医生诊断为大疱性表皮松解症(EB),并且告诉家人无药可治。哈桑一家后来逃避战乱来到了德国,这里的医生同样束手无策,与此同时伤越来越多。(注:有些交界型EB患者出生时比较轻)

2015年6月,因严重感染导致皮肤大面积脱落的哈桑住进了德国波鸿儿童医院的烧伤科。此时他身体60%的皮肤缺失,背部、躯干两侧、四肢已经形成了大片连续的伤口。入院5周后情况并没有好转,反而逐渐恶化,伤口进一步扩大。由于感染、营养不足,体液失衡等原因濒临死亡

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移植前大面积的表皮剥脱。图片来自论文

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表皮缺损情况示意图,红色为表皮缺失,绿色是水疱区域。红色和绿色部分都做了皮肤移植。图片来自论文

他们联系了意大利摩德纳雷焦艾米利亚大学的干细胞生物学家Michele de Luca教授(下文称为德卢卡教授),过去的数十年中德卢卡教授一直致力于为EB患者重建皮肤。他的方法是从患者身上收集干细胞,引入正常的基因,用纠正过的细胞培养出健康的皮肤并移植回患者身上。

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德卢卡教授尊容,来自网络

德卢卡教授和同事们2006年就尝试过这种方法,他们成功地治疗了一名49岁的女性JEB患者,不过当时移植的皮肤面积比较小。蝴蝶宝贝关爱中心曾在网站上介绍过,见于《遗传性皮肤疾病基因疗法的首次成功》。

2015年9月,医生从哈桑的腹股沟处取了4平方厘米皮肤,分离出干细胞,转入正确的基因后培养成了皮片。在10月和11月,他们分两次把皮片移植回哈桑身上。到移植的时候哈桑身上已经有80%的体表面积没有皮肤了。最后在2016年1月又修补了一些零星的无皮区域。

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培养出的皮片长这个样子。图片来自网络

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细胞转染、培养、移植的过程。图片来自论文

移植做了三次,手术本身很困难,特别是第一次,因为这时候哈桑身上的破损面积最大。移植后为了维持绝对静止,哈桑连续12天处于持续麻醉状态下。

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移植过程。图片来自论文

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移植后患者的整个表皮得以重建,只在上图圈出的少数几个地方仍有皮损。此后这些皮损的位置被周围的好皮肤修复了。图片来自论文

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移植后的皮肤可以捏起来。EB患者应该都知道这种动作会导致患病的皮肤产生水疱。图片来自论文

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移植后做活检的地方也没有水疱。图片来自论文

2016年2月,哈桑出院。3月,回到学校。他不再需要药膏,皮肤很结实,也不再瘙痒。德卢卡说:“他一个水疱也没有再长过,体重增加了,参加体育运动,有了正常的社交生活。”

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哈桑在踢足球。图片来自网络

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哈桑脸上的皮肤像用过美颜一样。图片来自网络 

一些烧伤患者做过皮肤移植,取患者自己的皮肤培养成皮片再移植回去。由于烧伤会破坏深层皮肤,很多这样移植后的烧伤患者皮肤上没有毛发或汗腺,这些患者需要终生每天两次用油膏滋润移植后的皮肤。哈桑移植后的皮肤上有毛发和汗腺,不需要使用油膏。

移植的效果超级好,完全是美梦成真!愿哈桑从此能享受正常的生活!

2. 基因治疗+皮肤移植技术详解

2.1.  EB患者能不能做普通的皮肤移植?

烧伤患者做同种异体皮肤移植已经出现很久了,为什么不用来自健康人的皮肤移植到EB患者身上来改善皮肤情况?

普通的皮肤移植只是短时间覆盖患者的伤口,防止感染及患者的体液流失。经过一段时间后外来的皮肤会被人体排斥掉,患者会长出自己的皮肤。烧伤患者自身的皮肤细胞是正常的,重新生长出来以后能起到正常皮肤的功能,短期的移植覆盖能帮助患者度过危险期。而EB患者重新长出来的皮肤仍然是“坏”的,做皮肤移植没有长期效果。

所以对EB患者需要用转入正常基因的自体细胞做移植,不能做同种异体移植。

实际上哈桑在这次住院期间曾因皮损过于严重接受了他爸爸的皮肤移植,在移植14天后完全脱落。

2.2.  怎样修复细胞中的基因缺陷?

哈桑的疾病原因是LAMB3基因突变。德卢卡用一种改造过的逆转录病毒载体,把一份正确的LAMB3基因封装在病毒载体中,转入从哈桑身上提取的干细胞中。正确的LAMB3基因插入了细胞的染色体中,此后可以随着细胞的分裂而复制。转染过的干细胞的后代就有了一份正确的LAMB3基因,从而可以制造正常的层粘连蛋白332。

2.3.  怎样防止基因编辑的风险?

如果携带LAMB3基因的病毒载体整合到了染色体上的某个基因内部,可能会破坏原有基因的功能。如果整合的位置临近原癌基因,还可能触发癌症。为了保证外来基因尽量不整合到正常基因中,同时尽量不激活原癌基因,首先需要选择合适的病毒载体。

德卢卡教授选择的病毒载体本身比较安全。他们分析了转基因之后的皮肤干细胞,发现2万多种整合模式。其中47%位于内含子中,38%位于基因间的空白区,小于5%破坏了现有的基因。这个数据说明外来基因的整合可能会产生一些问题,但问题不严重。

同时他们分析了细胞培养中整合模式的变化,没有发现癌基因触发后可能出现的优势细胞群,这就间接说明没有触发癌基因。同时2006年的移植和本案例的移植到现在为止都没有发生癌症,也从事后说明这种技术安全性较高。

但是理论上说这种靠逆转录病毒载体携带基因进细胞的模式不是绝对安全的。每一次转基因之后都需要评估安全性。更安全的方式是使用CRISPR编辑基因。

但另一方面对很多EB患者来说,不采取治疗措施会有长期不愈合的伤口,也可能诱发皮肤癌。做移植反而癌症的风险小。

2.4.  移植的皮肤能不能长期起作用?

前面提过的2006年意大利的患者经过12年之后,移植的皮肤仍然完好。本例中的哈桑,在移植后4个月、8个月和21个月的时候分别做了移植皮肤的活检,都发现皮肤的结构完整,表皮真皮交界处已经得到修正。同时患者的血清中没有检测到针对皮肤基底层的任何自身抗体。最后这一点也很重要,说明因移植而增加的蛋白质没有引起人体的排异反应。

同时德卢卡教授也检测了移植后的皮肤,在其中确认了有具有全克隆能力的细胞(即干细胞),并且验证了在8个月之后新的皮肤完全来自这些干细胞。这就从细胞层面说明新的皮肤具有永续更新的能力。

2.5.  交界型患者的体内粘膜怎么办?

交界型患者不光体表的皮肤有问题,体内的粘膜,特别是呼吸道粘膜也会受损。一些特别严重的交界型患者呼吸道的损害很严重,是一种重要的致死原因。

看到这个新闻之后不少EB患者家属提出了如何治疗粘膜的疑问。遗憾的是目前这种皮肤移植的方法还不能用于改善体内的粘膜。

但本案例的患者可能体内粘膜受累不重,属于中度泛发性JEB。论文中说哈桑在入院前六周情况开始恶化,原因是金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌感染。所以哈桑本身的JEB并不是特别严重,之所以发生这么严重的情况可能是因为护理有缺陷。

哈桑本身的疾病不是特别严重,从论文中能看出来。首先他的突变是剪切位点突变,这种突变经常是导致相应的蛋白质数量极大地减少,而不是完全缺失。既然还有少量的蛋白质,也就能维持一部分皮肤的功能。

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左边是正常人,右边是哈桑移植前。绿色代表哈桑缺少的层粘连蛋白的成分。从图中能看到哈桑并不是完全缺失,而是数量特别少。图片来自论文

2.6.  这种方法能不能用于其它类型的EB?

理论上同样的方法也可以用于其他隐性遗传的EB亚型。但通过逆转录病毒载体把基因转入细胞的方法对基因的大小有限制,而编码VII型胶原的基因COL7A1特别长,这种方法如果用到RDEB患者中转染的效率可能会明显降低。或许应该使用更好的把正确基因转入细胞的方法。细胞经过矫正之后,培养皮片再移植回患者的方法都一样。

这种移植方法只能用于体表皮肤,严重的交界型和RDEB患者体内粘膜也会受累。目前看来这种方法对严重泛发性交界型EB患者无法解决呼吸道的问题,并且很可能无法避免患者死亡。

严重泛发性RDEB患者受累的粘膜主要是消化道,改善体表皮肤后即使消化道仍然有问题也能极大地提高生活质量,至少体表的伤少了以后生活自理能力增强,同时通过伤口流失的体液减少,也减少了愈合伤口需要的营养。

很多RDEB患者有严重的并指。如果做分指手术后用这种方法覆盖裸露的手指和手掌,应该也能长期防止再次并指。

显性遗传的EB患者不能通过转入一份正确的基因解决问题,一般显性遗传的症状比较轻,也不应该做这种伤害很大的皮肤移植。目前的研究方向是开发能使错误基因沉默的siRNA,做成药膏体外涂抹。

总的来说这次的治疗是一个突破,毕竟以前还没有EB患者被“治愈”过,这次基本上算“治愈”了。这种方法应该可以直接用于其他中度泛发性JEB患者。但不能直接用于其他类型EB患者。

对其他EB患者如果做皮肤移植的话,一般来说没有必要短期内做这么大面积的移植。实际上“治愈”长期不愈合的伤口对EB患者的生存已经有重大改善了。

对其它类型的EB,实际上美国和欧洲现在已经有相应的临床试验项目了。可惜中国还没有。希望中国的研究人员能迎头赶上。

2.7.  当前的研究是否只关注严重的EB亚型?

实际上对相对不严重的EB亚型也有一些研究项目在进行,国际DebRA的网站上列出了当前在进行的各种研究,很多研究得到了国际DebRA的资助。

2.8.  这次手术的费用是多少?

临床试验对患者是免费的。

在欧洲进行的典型的临床试验费用会超过一百万欧元。这次试验的费用估计需要几百万欧元。(这是国际DebRA的估计)

2.9.  这次皮肤移植有哪些意义?

首先这次皮肤移植和一般移植不同的地方在于使用了转基因的皮肤细胞。

这次移植尝试了两种培养皮片的方法。一种方法是培养在塑料表面,另一种方法是培养在纤维基质上。后一种方法更简便。两种方法都成功,说明对JEB患者可以用后一种方法培养皮片。

2006年在意大利做的移植,面积很小,只有0.06平方米,对患者的生活质量改善不大。这次移植的总面积有0.85平方米,并且在此后持续21个月的回访中皮肤的强度一直很高。说明培养皮片移植的方法可以用于治疗全身性的皮肤疾病

皮肤是人体最大的器官,发散一些考虑的话用基因矫正过的自体细胞做皮肤移植,或许还可以用于其它疾病的治疗。比如某些患者因为基因突变身体中缺少某种酶,这种酶需要的量很少。如果能有一块儿皮肤可以产生这种酶,或许通过循环系统分布到全身就可以极大地缓解原先的症状,相当于自身携带了药物工厂。而做皮肤移植的好处是移植物在表面,如果有癌变等不良反应,很容易观察到并处理掉。

2.10.     DebRA有什么作用?

蝴蝶宝贝关爱中心的英文名是DebRA,DebRA是各国EB患者组织的共同名字。本次试验的资助方包括奥地利DebRA和意大利一家区域性DebRA。

创造奇迹一方面靠理想,另一方面也靠资金。有志于推动EB的研究继续前进的你,可以选择资助蝴蝶宝贝关爱中心。

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发表于:2017-11-10 16:41

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