铁剥夺对K-562细胞中NF-κB基因表达的影响

王西阁 汤有才 陈斌 牛文忠郝庆飞

郑州大学第三附属医院 儿科 河南 郑州450052

[摘要] 目的 观察去铁胺(Desferrioxamine, DFO)诱导K562细胞凋亡时NF-κB基因表达的变化。方法 以不同浓度的DFO处理K562细胞，分别在12、24和36小时收取细胞。用Annexin V/PI对K562细胞进行双标记后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。用RT-PCR半定量法检测NF-κB mRNA的表达水平。结果 K562细胞经不同浓度的DFO处理后，细胞发生明显凋亡。NF-KB的表达与各时间点的对照组相比较，除了12小时10μmol/L组差别无显著性外，其它各组均与相同时间点对照组的差别有显著性(P<0.05)。 结论 DFO诱导K562细胞凋亡，且呈时间剂量依赖性；DFO抑制了NF-κB在K562细胞中的表达。

[关键词] K562细胞；去铁胺；细胞凋亡；NF-κB

The Effect of Expressions of NF-κB Gene in K-562 Cells by Iron Deprivation

Wang Xi-ge,Tang You-cai, Chen Bin, Niu Wen-zhong, Hao Qing-fei

Abstract Objective To observe expression of NF-κB in apoptosis of K562 cells induced by Desferrioxamine.

Methods K562 cells treated with desferrioxamine at various concentration for 12h, 24h and 36h were collected for experiment.The ratio of apoptosis in K562 cells was measured by flow cytometry after labeled with Annexin V/PI and expression of NF-κB was detected by RT-PCR. Results The apoptotic ratio of K562 cells increased gradually after treated with DFO. Comparision with control group, the expression of NF-κB decreased significantly(P<0.05),except the group of 10μmol/L at 12h time point. Conclusions Our results suggest that DFO may induce apoptosis in K562 cells through inhibiting expressions of NF-κB.

Key words: K562 cell;Desferrioxamine;Apoptosis;NF-κB

铁是生命活动必不可少的营养元素，是许多酶包括呼吸酶、合成DNA的限速酶—核糖核酸还原酶的辅因子,在细胞的DNA合成、电子传递、氧气的运送、解毒等诸多生理过程中起及其重要的作用。铁剥夺是指应用铁螯合剂螯合铁离子、促进铁排泄从而起到降低细胞内外铁的作用。肿瘤细胞生长及增殖也需要摄取足量的铁。近来研究发现铁剥夺可以对抗氧化应激损伤、抗细胞增殖及诱导细胞凋亡及诱导细胞分化^[1,2]；也有研究显示铁剥夺可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性^[3,4]。部分研究发现,铁剥夺有望成为肿瘤的治疗方法之一。近年研究表明,NF-kB转录因子在控制细胞增殖和凋亡中起重要作用^[5]，已是目前靶向治疗肿瘤的研究热点。本文观察铁剥夺剂-去铁胺诱导K562细胞凋亡时NF-κB基因的表达变化，希望寻找一种安全有效的NF-κB抑制剂。

1 材料与方法

1.1 材料 K562细胞(儿科化验室保存)。去铁胺(Desferrioxamine, DFO) (瑞士产)。RPMI-1640(Gibco公司)。新生牛血清(四季青)。Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒（北京博大泰克）;Trizol(Invitrogen);一步法RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程公司)

1.2 方法 1.细胞培养:将K562细胞置于体积分数为10%新生牛血清RPMI-1640培养基中,37℃、5%二氧化碳孵箱中培养；取对数生长期细胞,0.4%锥虫蓝染色细胞活性98%以上,调整细胞密度为1×10⁶个/mL， 4ml/孔接种于6孔板进行实验。2.分组:DFO(10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)组；空白对照组(加生理盐水)；每组3个复孔。3.实验检测:分别取培养12、24、36 h的K562细胞，用Annexin Ⅴ法检测凋亡率；RT-PCR法检测NF-κB基因表达情况。

1.3 K562细胞凋亡率测定 将正常培养和各时点的悬浮细胞(0.5～1.0) ×10⁶ 个收集到离心管中,1000 rpm离心5 min,弃去培养液, PBS洗2次。将细胞悬浮在200μl结合缓冲液中,加入10μlAnnexin Ⅴ-FITC和10μlPI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。加入300μl结合缓冲液,在1个小时内上流式细胞仪行分析，同时以不加Annexin Ⅴ-FITC和PI的试管作为阴性对照。激发光波长为488 nm,用波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光,用波长> 560 nm滤器检测PI。

1.4总RNA提取、纯化及浓度测定 离心收集不同条件下培养K562细胞,用Trizol (Invitrogen),按照说明书提供方法提取、纯化总RNA,置37℃温箱至半干沉淀加入20ulDEPC处理过的水中,-80℃保存,紫外分光光度计测定各样品RNA含量。

1.5 RT-PCR分析 按一步法RT-PCR试剂盒推荐条件操作,以β-actin作为内参照。转录引物:

NF-κB 415 bp: s 5\\"AGCACAGATACCACCAAGACC3\\"

a 5\\"GGGCACGATTGTCAAAGAT3\\"

β-actin 548bp: s 5\\"GGGACCTGACTGACTACCTC3\\"

a 5\\"GGACTCGTCATACTCCTGCT3\\"。

以上引物由北京奥科生物技术公司合成。取PCR扩增产物经18 g/L琼脂糖凝胶电泳分离及溴化乙锭染色。采用Quantity One4.2.3图像分析系统进行电泳区带光密度扫描分析,计算NF-κB与β-actin电泳区带信号强度比值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件处理,数据以均数±标准差( )表示,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 K562细胞凋亡率测定 用不同浓度的DFO(10μmol/L, 50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)处理K562细胞后，细胞凋亡率见表-1。

表-1不同处理因素对K562细胞凋亡率的影响( )%，(N=3)

注：* 表示与相同时间点的对照组比较P<0.05；△ 表示与相同浓度DFO处理组的12小时组比较P<0.05。

2.2 DFO对K562细胞NF-κB基因表达影响 与各时间点的对照组相比较，除了12小时10μmol/L组差别无显著性外，其它各组均与相同时间点对照组的差别有显著性(P<0.05)。见表-2及图-1

表-2 DFO对K562细胞NF-κB基因表达的影响

注：* 表示与相同时间点的对照组比较P<0.05。

图-1 DFO 100μmol/L时 NF-κB的表达。

注：图中泳道1、3、5 为β-actin；2 DFO处理12h；4 DFO处理24h；6 DFO处理36h

3 讨论

铁是细胞生长及维持正常功能活动的基本元素，而铁超载会损伤组织细胞^[6~10]并能促进肿瘤的发生与生长^[11,12]，DFO是一种水溶性的、六齿状铁剥夺剂，可高度选择性地与三价铁离子结合，是临床治疗慢性铁负荷过重性疾病的药物。最近许多研究表明，DFO既可引起细胞增殖抑制，又可诱导细胞周期阻滞和凋亡^[13]，与我们应用Annexin Ⅴ、PI双标法检测细胞凋亡观察到的结果一致。

核因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）是1986年Sen和baitrimore首次从B淋巴细胞核抽提物中发现的一种与免疫球蛋白k轻链基因增强子相应序列（GGGACTTTCC）特异性结合的核蛋白因子，广泛存在于真核细胞浆中的一组转录因子。NF-κB是以同源或异源二聚体p65和p50的形式与抑制蛋白(inhibitor- κb,IκB)家族中的成员形成复合体，存在于细胞浆中。当细胞受到活化刺激后，NF-κB与其抑制蛋白IκB解离，然后自细胞浆进入胞核与其靶基因序列的基因启动子的KB位点结合，调控靶基因的表达。NF-κB可通过调控细胞因子的基因表达而间接地抑制自身及其他细胞凋亡或增殖，如激活后的NF-κB可调控IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-2、细胞间黏附分子-1、iNOS等多种细胞因子的转录^[14]。本系列研究的前期研究显示NF-κB蛋白在K562细胞中高表达，本研究显示，NF-κB mRNA在k562细胞中高表达，其表达量是β-actin mRNA的1.936倍；其表达量随着DFO的剂量增加及作用时间延长而减小。可能提示：DFO可能通过NF-κB途径诱导k562细胞凋亡。

总之，本研究显示，DFO诱导K562细胞凋亡，并且抑制了NF-κB在K562细胞中的表达。DFO从上个世纪60年代早期就有临床应用的报道，常规剂量应用下副作用小^[15]，有望成为一种安全有效的NF-κB抑制剂，但其通过那条途径影响NF-κB，仍需进一步研究。

参考文献

[1]汤有才，赵春，贾国存等.去铁胺抗K562细胞的增值作用及对细胞周期的影响 医药论坛杂志 2005，26（24）：9-11

[2]贾国存，汤有才，廖清奎等。铁剥夺对白血病细胞凋亡相关基因表达的影响. 实用儿科临床杂志，2005；20（1）：16-17.

[3]贾国存,刘玉峰,汤有才等.去铁胺联合阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡作用的实验研究.中国当代儿科杂志,2003,5(4):368-370.

[4] 赵春 汤有才 廖清奎等. 铁剥夺对柔红霉素诱导K562细胞多药耐药基因1表达及NF-κB活化的影响郑州大学学报，2005；40(2)：265-267.

[5] Didelot C,Barberi-Heyob M,Bianchi A,et al.Constitutive NF-κB activity influences basal apoptosis and radiosensitivity of head-and-neck carcinoma cell lines.Int J Radiat Oncli Biol Phys,2001,51(5):1354-1360.

[6] 张雅鸥.铁水平升高对机体的不利影响．国外医学输血及血液分册，1994；17(3):152-154.

[7] Cable EE , Connor JR , Isom HC. Accumulation of iron by primary rat hepatocytes in long-term culture : changes in nuclear shape mediated by non-transferrin-bound forms of iron[J].Am J Pathol , 1998 , 152 (3):781-792

[8] Ishida M, Nakagawara G, Imamura Y, et al . Iron and copper deposition in chronic active hepatitis and liver cirrhosis ; pathogenetic role in progressive liver cell damage [J] . Eur J Histochem , 1995 , 39 (3) : 221-236.

[9] Iancu TC , Deugnier Y, Halliday JW , et al . Ultrastructural sequences during liver iron overload in geneti chemochromatosis[J ] . J Hepatol , 1997 , 27 (4) : 628-638.

[10] Voogd A , Sluiter W, van Ei jk HG, et al. Low molecular weight iron and the oxygen paradox in isolated rat hearts [J ] J Clin Invest , 1992 , 90 : 2050 - 2055.。

[11] Takkunen H,Reunanen S,Kneke P,et al.Body iron stores and the risk of cancer NEW Engl J Med.1989,320:1013-101.

[12] Hann HL,Stahlhut MW,Blumberg BS.Iron and tumor grouth,decreased tumor growth in iron-deficient mice Cancer Res.1988,48:4168-4170.

[13] Le NT, Richardson DR. The role of iron in cell cycle progression and the proliferation of neoplastic cells[J].Biochem Biophys Acta,2002, 1603(1):31-46.

[14] 向国胜，孙方臻．转录因子NF-KB／IKB．细胞生物学杂志，2001．232：71-76．

[15] 夏婷，方建培．去铁胺和deferiprone的临床研究进展．国外医学儿科学分册，2005.32(1):40-42