我的研究分享
发表者：方清 人已读
前言：
这是我2004年写的一直没有发表的一篇论文，因为写作水平不够，夹杂了很多个人的推测成分，因此没好意思去投稿。现在就拿来和喜欢专研的病友们分享一下吧。由于HBVCCCDNA近些年来研究进展很有限，所以现在看起来它仍然不过时。
缺陷是美，缺陷是进取的动力源泉，不仅病毒如此，人也不例外，珍惜缺陷所给予的机会，而不是停留于缺陷，生命会因为缺陷而充满意义。
在对HBV（乙肝病毒）复制周期的学习和对病毒复制模板HBVCCCDNA的了解与研究中，我为病毒的适应生存环境而主动进行的完美自身调控机制所折服。其实乙肝病毒本身就是肝脏细胞内的一个寄生物，除了核酸和逆转录酶算自己的，其他时候就像细胞内的主人一样，也随时在克制自己以维护生存环生存环境的稳定健康 ，从而确保自己的存在。因此在相当一段时间内，科学家们找不到乙肝病毒直接伤害肝脏细胞的证据，即便现有有了若干证据，其实也很微不足道。对于有兴趣来了解HBV的病友或公众，你们可以看看本人的下面文章，不难发现乙肝病毒的生命体系有多么“完美”且“简约”。
同时也利用此文和我同期的另外一篇文章《慢性乙肝感染者肝移植术后HBV再感染》为基础写点小文章《核苷酸类似物能够将机体内的乙肝病毒赶尽杀绝吗？No!》，给医生同行们参考一下，以便了解核苷酸类似物对于乙肝病毒复制模板HBVCCCDNA和对于肝脏外的乙肝病毒储存池的作用是多么有限。是的，核苷酸类似物和干扰素确实是被目前科学临床试验证明的对病毒复制肯定有作用的药物，乙肝病毒的长期存在也确实可以被认为是导致乙肝不良预后的病因，然而这并不能推导出只有这两种药物的使用可以抑制病毒复制，更不能荒诞的认为只有使用这两类药物才是对乙肝唯一有效的干预措施，是延缓肝硬化和肝癌的唯一有效干预措施。现在这种空气弥漫，值得所有医生和病友警觉啊。
相关文章：
核苷酸类似物能够将机体内的乙肝病毒赶尽杀绝吗？No!
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新进展补充：
cccDNA水平与病毒学应答（陈力元教授
患者肝组织病毒cccDNA水平与其治疗应答相关,血清HBsAg水平可作为肝内cccDNA的替代标志物
HBV的共价闭合环状DNA（cccDNA）是肝内病毒复制的模板。在两项有关聚乙二醇干扰素联合拉米夫定治疗慢性乙肝的研究中，陈教授等研究了cccDNA与治疗应答的关系。
在研究中，他们比较了在HBeAg阳性慢乙肝患者中聚乙二醇干扰素联合拉米夫定与单用拉米夫定的疗效，研究结果发表在《内科学年鉴》（Ann Inter Med 2007）杂志上。
他们在研究中还发现，对于接受治疗的慢性乙肝患者，1年的治疗结束后，患者血清HBV DNA水平与其肝内cccDNA水平及肝内总HBV DNA水平存在良好的相关性，持续应答的患者肝内cccDNA水平及肝内总HBV DNA水平显著降低。与血清HBV DNA水平相比， 肝内cccDNA水平及肝内总HBV DNA水平预测病毒学应答的效果更好。这反映了免疫控制对疾病缓解的重要意义，该成果发表在《胃肠病学》（Gastroenterology 2005，128：1890）上，并引起了学术界对cccDNA的极大兴趣。
在随后的小型临床研究中，他们对患者在接受聚乙二醇干扰素联合拉米夫定治疗前后均进行了肝活检，结果显示，治疗应答者的cccDNA显著降低，而未应答者则不降低。
由于测定cccDNA需要通过肝活检，并不是每例患者都能接受这种有创检查。因此，研究出一种无创标志物用于临床变得迫在眉睫。
在陈力元教授等的研究中，患者血清乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的定量检测结果与其肝内cccDNA水平具有非常好的相关性，这提示可考虑将血清HBsAg作为替代cccDNA的标志物。 同时，该项研究也为今后探讨血清HBsAg在预测干扰素治疗应答中的作用奠定了基础。
乙型肝炎病毒cccDNA池的若干问题初步探讨
方清 赵连三
（四川大学华西医院四川省感染病分子生物学重点实验室 成都， 610041）
嗜肝DNA病毒是一类能在多个动物种属中引起肝细胞持续感染的DNA病毒，目前该家族病毒被归入DNA反转录病毒类嗜肝病毒科。该科又被划分为两个属：正嗜肝DNA病毒属（人乙型肝炎病毒，土拨鼠肝炎病毒，地松鼠肝炎病毒等等）、禽嗜肝DNA病毒属（鸭乙型肝炎病毒等）。嗜肝病毒基因组DNA是双链、松弛、有开口的环状DNA分子(relaxed circular DNA, rcDNA)。
在嗜肝DNA病毒感染的肝细胞核内，主要检测到的却是一种不同于rcDNA形式的病毒DNA，即超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子 (convalently closed circular DNA， cccDNA )。cccDNA分子是嗜肝病毒科病毒基因组的复制中间体，是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板，是嗜肝病毒持续感染的关键因素。
目前认为cccDNA分子只存在于嗜肝DNA病毒感染的肝细胞核内。在每一个稳定感染的肝细胞核内，cccDNA分子的数量维持在一定水平，被形象地称作“cccDNA池”（the pool of covalently closed circular viral DNA）。cccDNA池形成于嗜肝DNA病毒感染细胞初期阶段，在形成时间关系上，早于成熟病毒颗粒的细胞外分泌。可以说，cccDNA池的存在标志着嗜肝DNA病毒复制周期的存在，cccDNA池的存在是嗜肝DNA病毒持续感染的关键因素。
一、cccDNA池现象的认识过程及其内涵
cccDNA池的称谓最初由Summers J等提出[]。它是描述在嗜肝DNA病毒感染肝细胞初期，成熟病毒颗粒内的rcDNA 分子在细胞核转变为cccDNA分子之后，病毒复制周期中新合成的rcDNA 分子不是形成成熟病毒颗粒分泌至胞外，而是入胞核转变为cccDNA分子，多轮循环后，直至cccDNA分子数量扩增了约50倍后，新合成的rcDNA 分子才进入内质网进行病毒外壳包装、成熟，分泌至胞外，此时肝细胞核内聚集的cccDNA分子被形象地称为cccDNA池，cccDNA分子扩增的过程被称为cccDNA池的形成。
在肝细胞感染持续阶段，肝细胞核内cccDNA分子的数量也维持在相对稳定的水平，通过胞浆内rcDNA与胞核cccDNA分子的相互转化，平均每个肝细胞核内的cccDNA分子保持在5~50个，该现象被称为cccDNA池的维持。
以上是对cccDNA池最初的认识，主要是对cccDNA分子在其生存的肝细胞核环境中存在数量的特征性描述。对cccDNA池动力学研究就是对cccDNA分子数量变化规律的研究，它包括了目前对cccDNA池的形成、cccDNA池的维持、cccDNA池的衰亡三个阶段，各个阶段均有各自的动力学变化特征的规律，而且当生存环境发生改变时，上述三个阶段的动力学变化特征也可能发生相应的改变。目前通过对的研究，已初步认识到了肝细胞cccDNA池的形成和cccDNA池的衰亡的动力学变化特征的，通过对嗜肝DNA病毒体内感染的研究，对肝脏cccDNA池的衰亡的动力学研究也取得一定进展。
广义的cccDNA池是反映整个宿主体内存在的cccDNA分子群体的生存状态的定义。它的定义目前还没有真正形成，它的内涵至少包括以下几方面：
1、cccDNA池研究的空间范畴应包括细胞、器官、系统、个体四个层面，狭义的cccDNA池目前主要涉及肝脏细胞与肝脏器官。
2、cccDNA池研究的数量范畴，即cccDNA池内cccDNA分子的数量。
3、cccDNA池研究的理化范畴，即cccDNA池内cccDNA分子的理化特征。包括cccDNA分子的病毒小染色体结构的特征、功能状态、cccDNA的寿命。
4、cccDNA池研究的基因异质性范畴，包括cccDNA池内基因异质性的来源，基因异质性的维持、基因异质性的更迭等等。
5、cccDNA池的外延范畴，包括
1）、cccDNA与其他病毒核酸存在形式、蛋白表达产物等的关系，即cccDNA分子和cccDNA池在嗜肝DNA病毒感染生活史中的病毒生物学意义。
2）、cccDNA池与生存环境的关系，涉及cccDNA池在各个层面与宿主细胞、组织器官、系统、个体的关系，集中体现在cccDNA池的动力学变化和cccDNA基因异质性的变迁。
总之，cccDNA池的概念是开放性的，随对其研究的深入，其内涵将不断拓宽。
二、从cccDNA池广义的范畴来探讨cccDNA池的研究现状
cccDNA池的核心都是服务于病毒的生存。每一个肝细胞核就可以存在一个cccDNA池，正如每一个肝脏细胞都是独立存在，可以发挥独立的功能，所有的肝脏细胞在整体上构成了肝脏器官，但是肝脏器官的功能却不仅是每一个肝脏细胞功能的累计，还存在有整体效应。
病毒感染初期，cccDNA池的形成早于成熟病毒颗粒的形成，其病毒生物学意义在于不仅迅速扩大了病毒复制模板量，而且可能通过延缓感染初期宿主免疫系统产生的抗HBV特异性免疫应答，有利于病毒的立足，从而更易导致持续感染的发生。
病毒感染稳定期，通过cccDNA池的调节机制，维持肝细胞核内cccDNA分子数量于合适的水平，既满足病毒复制又对肝细胞无毒性。有利于维持病毒的复制水平适应于其生存的特定环境。
目前对cccDNA池的认识还主要停留在对cccDNA池内的cccDNA分子数量变化规律的认识，这仅仅是对cccDNA分子生存状态的浅显描述，cccDNA池的本质是反映了乙肝病毒在宿主体内的种群生存状态的要求，不仅仅需要肝细胞核内要维持一定的病毒复制模板量，更重要的是维持一定的病毒基因异质性，以适应生存环境的变化。cccDNA池的变化规律不仅仅是对cccDNA分子数量变化的描述，更重要的是对cccDNA分子在cccDNA池内生存质量规律的研究，要回答HBV是如何通过在cccDNA池内进行基因异质性的选择，以最佳的生存方式适应宿主的生存环境
2、cccDNA池与其生存的环境（肝脏细胞等）之间是一对矛盾，既有同一性，又有斗争性。同一性表现在二者的共同生存，cccDNA池能适应肝细胞的生存环境，肝细胞所受影响有限，一般不影响其正常功能的功能，同一性体现了HBV对环境的适应力，以病毒为主；斗争性主要体现在cccDNA池与宿主免疫系统的关系，病毒作为寄生物，是免疫系统清除的对象，免疫系统将发挥主导作用，免疫系统的功能状态如何将决定HBV的生存状态，肝细胞损害将是主要代价。
其内涵包括：1)、cccDNA池内cccDNA分子数量在每一个肝细胞核内以动态平衡的变化方式波动在相对稳定的数量范围内，以满足病毒复制的要求，而又不造成细胞毒性。cccDNA池的扩增主要受到病毒复制产物的负反馈调节，同时也受到细胞周期的影响。2)、cccDNA池内存在基因异质性。cccDNA的扩增不是通过半保留复制，而是通过前体rcDNA入核转变而来。由于病毒复制过程中，病毒逆转录酶缺乏校正功能，每一次病毒复制最终产生的rcDNA分子核苷酸序列难以完全一致，故其为前体形成的cccDNA分子之间也存在有基因异质性，所有cccDNA分子之间的核苷酸序列差异即构成cccDNA池的基因异质性。它是病毒适应生存环境的重要保证，是选择病毒变异株的内在根源。3)、cccDNA池内各cccDNA分子与组蛋白结合的状态呈现多样性。每个cccDNA分子形成的病毒染色小体所拥有的核小体的数量并非恒定，可波动于0~20个之间，且核小体与核小体之间的连接片段（linker）非常短，与真核细胞染色体上的核小体结构有明显区别[2]。推测各cccDNA分子的稳定性以及转录活性状态可能存在差异，cccDNA分子是不是通过与组蛋白的不同结合方式而决定cccDNA分子的不同寿命状态，从而在病毒能进行完整复制周期时，实现cccDNA池内cccDNA分子的更迭；而在病毒不能进行完整复制周期时，尽可能延长cccDNA分子的寿命，维持cccDNA池的持久存在。4)、cccDNA分子大部分来源于rcDNA，少量来源于线状DNA[3]，不同来源的cccDNA分子的病毒生物学意义存在差别。总之，cccDNA池的内涵还有待深入研究，但可以肯定的是其与病毒逃避宿主免疫压力、耐受抗病毒药物治疗以及发生病毒变异等等病毒生活史中的重大事件均密切关联，cccDNA池的持续存在是造成HBV持续感染,并且难于被目前药物根治的主要原因。
感染初期cccDNA池的形成及其病毒生物学意义
cccDNA池的形成发生于肝细胞感染病毒初期阶段, 而且感染初期肝细胞核内cccDNA池的形成先于成熟病毒颗粒的胞外分泌，故cccDNA池是病毒复制产生成熟病毒颗粒的基础。Summers J等[4][5]在DHBV感染肝细胞系的体外研究中发现，病毒感染肝细胞的初期，cccDNA分子在肝细胞核内出现的时间早于病毒mRNA以及单链病毒DNA（single-stranded DNA，ssDNA），是病毒感染后被检测到的第一种病毒复制中间产物。病毒感染4天后cccDNA便扩增了50倍形成所谓cccDNA池，而此时培养液中尚不能检测到新产生的病毒分泌颗粒。此外，随后的研究证实cccDNA池的扩增是通过在细胞浆由病毒复制新产生的rcDNA重新进入细胞核转变而来, 而不是通过细胞核内cccDNA的自身半保留方式复制。推测
此外， rcDNA分子能否进入细胞形成cccDNA分子与cccDNA分子能否通过扩增建立cccDNA池可能是HBV能否复制的两个不同环节。cccDNA池的能否建立也可能决定了HBV感染、复制的组织器官嗜性。
2.2 cccDNA池扩增的方式及调节机制 在肝细胞持续感染阶段，肝细胞核内cccDNA与肝细胞浆内rcDNA之间始终处于相互转化的动态平衡之中，以维持cccDNA池的水平相对稳定，既满足病毒复制又对肝细胞无毒性。胞浆内HBV核心颗粒表面核心蛋白的细胞内亚定位信号将决定rcDNA是入核形成cccDNA还是入内质网包装加工最终形成病毒成熟颗粒分泌至胞外。该信号序列存在于核心蛋白羧基端精氨酸富集区的145～156位及172～183位氨基酸残基之间[6]，这些氨基酸残基的磷酸化与脱磷酸化可精确调控rcDNA是否入核转变为cccDNA。但是具体调节机制目前尚不很清楚，可能是通过病毒主导的或细胞主导的负反馈机制来完成[7][8]。
2.3 肝细胞周期对cccDNA池扩增的影响。
rcDNA在G1期优先进入细胞核形成cccDNA，而在S期则优先进入内质网形成成熟病毒颗粒分泌至胞外[9]。体外试验证实HBV rcDNA入核有关的C蛋白其细胞内亚定位具有细胞周期依赖性[10]，而且病毒基因产物和肝细胞周期对cccDNA池扩增的作用可同时存在[11]。推测其病毒生物学意义在于肝细胞处于G1期有利于cccDNA池的扩增，从而有利于病毒感染的初期的立足，而S期的肝细胞则反之，有利于减少病毒对宿主细胞染色体组复制期间的干扰，从而不妨碍宿主细胞正常生存。
2.4 宿主免疫系统对cccDNA池的影响
不论是在急性乙肝病毒感染期初期还是慢性乙肝病毒感染期，一旦rcDNA进入肝细胞，宿主免疫系统均不能阻止感染初期cccDNA池的形成。但是急性乙肝病毒感染的可恢复性提示宿主免疫系统有清除cccDNA池的能力，只是确切机制目前尚不清楚。目前认为[12][13][14]，cccDNA池的清除可能通过非溶细胞性和溶细胞性两种途径，而且以前者为主。除了以外周血淋巴细胞为主介导的特异性免疫应答外，肝脏细胞特别是肝脏的枯否氏细胞介导为主的非特异性免疫应答可能也发挥了重要作用。Chisari 和Guidotti 等[12，15]在猩猩急性HBV感染实验中发现非溶细胞性清除HBV cccDNA主要是通过细胞因子的作用，而且主要是γ-干扰素（IFNγ）和肿瘤坏死因子a(TNFa)，特别是前者。但是迄今仍未能找到cccDNA能从未分裂状态的感染肝细胞核中被直接清除的证据。Chisari 和Schultz等[16]用重组鸭γ-干扰素（Du IFNγ）体外抑制DHBV的研究表明病毒感染后导致cccDNA的转换在IFNγ存在下仍可发生，但通过扩增形成子代cccDNA的过程被抑制。提示IFNγ并不能直接从细胞核清除cccDNA，而是通过抑制病毒复制阻断了子代cccDNA的合成。Moraleda等[17]研究提示cccDNA在未分裂的感染肝细胞核中非常稳定。ZHU等[18]和Addison等.[19]等对拉米呋啶体内抑制cccDNA的合成后cccDNA的半衰期研究还提示在病毒复制被抑制之后，感染肝细胞核平均cccDNA水平的缓慢下降主要通过感染细胞的死亡或有丝分裂将cccDNA分配到子代细胞内有关，而不是直接将cccDNA从未分裂的感染肝细胞核中清除的结果。cccDNA分子到底能不能被免疫系统直接清除还是一个谜。
2.5 抗病毒药物以及肝移植等治疗手段对cccDNA池的影响。
由于cccDNA的扩增方式不通过半保留复制复制方式，cccDNA在转录完成后并不直接降解，而是两条链重新结合继续留在细胞核内。目前抗病毒的药物如干扰素、核苷酸类似物等的作用靶点均在cccDNA转录之后的病毒复制环节，理论上不可能直接对转录模板cccDNA发生直接作用。相反，cccDNA池的基因异质性却有可能帮助病毒绕开药物的作用靶点而形成耐药。临床实践中也鲜有慢性HBV感染者被彻底根治的报道，只有在少数慢性HBV感染肝移植术后的患者存在有较长期不发生HBV再感染现象的报道。肝移植术后肝细胞核内的cccDNA池随病肝被整体去除，但是绝大多数患者在未经药物防治HBV再感染的情况下，迟早会发生HBV再感染。cccDNA 能不能存在于肝外组织器官的细胞中，肝外组织器官细胞在特定条件下能不能形成cccDNA池，从而成为肝移植术后HBV再感染的病毒来源，是当前及今后肝移植术后HBV再感染防治研究的热点。有关外周血淋巴细胞中检测出cccDNA已有报道[20]，但是结果尚未获公认。
3 cccDNA池的动力学研究
3.1 cccDNA池的半衰期和cccDNA分子的寿命 核苷酸类似物如拉米呋啶等能快速有效的抑制病毒复制水平，从而有可能切断cccDNA池扩增的来源，为研究相对静止状态下的cccDNA池的动力学变化提供了可能，近年来的研究都是基于此种前提，并已取得初步进展。过去一度认为 cccDNA半衰期很短，甚至只有数天[21]。目前研究初步发现WHV cccDNA池的半衰期在30~50天[18]，DHBV cccDNA池的半衰期在35～57天[19]，据此推测HBV cccDNA池的半衰期也可能与此相近；至于cccDNA分子的寿命有多长，有人认为至少与感染肝细胞等寿。但是从cccDNA池并非静止不动，而且存在需要更新的角度，本人推测 cccDNA分子在肝细胞核内存在某种降解机制，cccDNA池内的不同cccDNA分子的稳定性未必相同，它们的寿命也应存在明显差别，否则cccDNA池一旦形成，将只能扩增而不会减少，这与cccDNA池的动态波动、数量保持相对稳定的事实不符。
。
3.2 cccDNA池的清除途径与机制 根据上述研究成果，推测cccDNA池的减少可能通过以下三种主要途径：1）随感染肝细胞的死亡而被直接降解。2）随感染肝细胞的有丝分裂而被分配到子代细胞，从而使cccDNA池平均水平下降。3）新生的肝细胞受到某些机制的保护而避免了HBV再感染，从而使整个肝脏细胞中HBV感染细胞所占比例下降，从而导致整个肝脏细胞cccDNA池平均水平下降。已有研究证实慢性HBV感染者肝脏细胞半衰期明显缩短[]；临床病理中也发现慢性活动性乙型肝炎患者肝脏中存在HBV感染不均一，部分肝组织缺少HBV感染的迹象，而慢性HBV携带者肝脏组织者呈现较均一的弥漫性HBV感染。这些现象似可间接支持上述推测。当然，目前cccDNA的研究尚很肤浅，cccDNA池的清除机制远未阐明，上述推测有待今后进一步证实。试想从cccDNA、肝脏细胞和宿主免疫系统三者间复杂的关系出发，而不仅仅是考虑HBV与宿主免疫系统二者之间的关系出发，将有可能更准确地理解HBV感染状态与患者的预后之间的关系，为HBV感染的治疗提供新的思路。
6 参考文献
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发表于：2012-05-22
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