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李晓光主任医师 北京协和医院 神经科 肌萎缩侧索硬化百问百答 Q0,如何全面管理肌萎缩侧索硬化?如何提高患者生活质量,延缓患者疾病进展。 听到运动神经元病诊断,患者及家人大多不甘心,但随着疾病的逐渐加重,开始了解、接受该病的诊断。 心态稳定下来,要考虑具体要应对的问题就是,既然得了运动神经元病,该怎么办呢?如何让患者存活更长,减少疾病过程的痛苦? 首先,要多了解运动神经元病的相关知识,准确获得疾病相关信息,无论诊断及治疗都会少走弯路。 其次,一定要意识到,ALS是一种影响患者整个家庭生活的疾病,需要全程管理,患者和家人都须和该病长期共处,家人的参与至关重要。 患者或家人必需知道该病的六个方面,简单讲就是2020年02月06日 29 2 6
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王丽平副主任医师 北医三院 神经内科 熊去氧胆酸熊去氧胆酸是一种亲水性胆酸——中药熊胆中的主要成分,是目前治疗原发性胆汁性肝硬化主要的、也是唯一通过美国FDA审批的药物,还被广泛用于治疗包括原发性硬化性胆管炎和进行性家族性肝内胆汁淤积等在内的胆汁淤积型肝脏疾病。熊去氧胆酸及其衍生化合物牛磺酸熊去氧胆酸,可以通过稳定线粒体内膜、调控细胞凋亡途径上游靶标的表达、抑制细胞凋亡途径最上游的半胱天冬酶的激活等作用来抑制细胞凋亡,尽管其具体的作用机理尚不十分清楚。熊去氧胆酸所具有的抗细胞凋亡、免疫调节和抗氧化等作用可能被用于治疗ALS,但是用于治疗肝脏疾病的熊去氧胆酸胶囊或片剂含有酸性晶体,在酸性环境中溶解度极低,最终只能在小肠中经被动的非离子扩散被稀释和吸收,而且大部分会在肝脏中与甘氨酸或牛磺酸结合后随胆汁排出,因此很难进入中枢神经系统。后来开发的熊去氧胆酸口服增溶剂型可以克服这些缺点,使熊去氧胆酸可以高效地进入到脑脊液中,为其治疗ALS创造了机遇。早先的一项来自明尼苏达大学医学院的研究结果显示,口服剂型的熊去氧胆酸可以通过血脑屏障进入ALS患者的脑脊液中。熊去氧胆酸治疗ALS的III期临床试验起始于2005年3月,结束于2007年7月,试验为单中心、双盲、随机、交叉分组、安慰剂对照。共有80位ALS患者参加了试验,应试患者需满足以下条件:年龄>=20岁;发病=<5年;Appel量表指数在40~120之间;肺功能>=30%;可能或确定的散发性ALS患者。试验设计为交叉分组:先经过1个月的导入期;然后A组服药3个月,每天服用3.5克熊去氧胆酸/140毫升,B组服用安慰剂;之后为1个月的洗脱期;然后进行交叉——A组服用安慰剂,B组服药。对于这样的小样本数量临床试验,采用交叉分组相对于传统的平行分组的一个主要优势是,交叉分组方案可以尽可能地减小应试患者人群内部的系统误差。研究者采用交叉分组的另一个原因是出于医学伦理考虑——通俗地讲,就是阳光普照、来者有份儿,任何一个参加试验的应试患者都可以接受熊去氧胆酸的治疗。当然,这是建立在确信熊去氧胆酸对ALS患者具有正效果的基础上的——如果熊去氧胆酸对ALS患者具有负效果,那么到头来谁也跑不掉。在80位ALS应试患者中,最后A组有13位、B组有6位患者最终完成了试验;完成试验的应试患者共有19位,不足起始时人数的四分之一。应试患者极高流失率的原因包括:不符合统计分析条件,失去联系,不能按时随访,病情迅速恶化和因不良反应退出试验等。主要的不良药物反应均为消化道反应,包括腹痛、神经性厌食、腹泻和呕吐等。研究者认为应试患者基本上可以耐受熊去氧胆酸,但是患有急性胆囊炎或胆管阻塞等肝胆疾病的ALS患者,使用熊去氧胆酸时应抱有特别谨慎的态度,遵医嘱服用。在8个月的试验期内,应试患者共接受了4次终点事件检测。该项III期临床试验的结果显示,应试患者ALS病情指数和肺功能的变化,在熊去氧胆酸服药组和安慰剂对照组之间没有显著差异,说明熊去氧胆酸对治疗ALS无效。但是和对照相比较,熊去氧胆酸服药组应试患者Appel量表指数下降减缓了1.17点/月,说明熊去氧胆酸在该检测指标上可以减缓ALS应试患者的病情发展速率。在抽检的应试患者的脑脊液中均检测出了熊去氧胆酸的含量。研究者也承认,这是一项总体质量较差、可信度较低的临床试验,根本无法得出确定的结论;除了应试患者人数较少、熊去氧胆酸服药时间较短和终点事件检测时间点较少等显而易见的因素外,最主要的问题就是极高的应试患者流失率。研究者在报告中指出,导致大量应试患者纷纷退出试验的一个主要原因是因为这些患者的病情发展加快,因此不愿意再继续服药。同时,本着诚实的态度,研究者也强调了16名应试ALS患者服用熊去氧胆酸后病情发展显著加快(大于8点/月),而这些患者的试验数据被最终排除在统计结果之外!因此,综合考虑以上两点的话,熊去氧胆酸在该项III期临床试验中对ALS的疗效肯定会更加悲观。该项临床试验未在美国FDA登记,熊去氧胆酸使用在ALS治疗上也未经过美国FDA批准;其研究结果于2012年发表在《韩国医学杂志》上。牛磺酸熊去氧胆酸相比较熊去氧胆酸,对牛磺酸熊去氧胆酸的研究就要多得多。牛磺酸熊去氧胆酸也是一种亲水性胆酸,是熊去氧胆酸在人体肝脏中与牛磺酸相结合的内源性产物,被广泛用于治疗慢性胆汁淤积型肝脏疾病及胆结石等。牛磺酸熊去氧胆酸还在帕金森症、亨廷顿症、阿尔茨海默症、缺血性和出血性脑卒中等疾病的动物模型中展现出神经保护功能,相关体内和体外试验都显示出牛磺酸熊去氧胆酸在以细胞凋亡为病理特征的急性和慢性退行性神经病变中的抗细胞凋亡作用——牛磺酸熊去氧胆酸的这些特性暗示其可能被用于治疗ALS。牛磺酸熊去氧胆酸治疗ALS的II期临床试验为慈善组织资助,非商业组织行为。试验开始于2008年6月,结束于2012年4月,为三中心、双盲、随机、平行分组、安慰剂对照。共有34位ALS患者参加了试验,其中29位应试患者(15位牛磺酸熊去氧胆酸服药组和14位安慰剂对照组)最终完成了试验。应试患者需满足以下条件:年龄18~75岁;发病=<1.5年;肺功能>=75%;服用利鲁唑;四肢起病;可能或确定的ALS患者。试验方案为:先经过3个月的导入期;然后应试患者服药1年,每天2次、每次1克牛磺酸熊去氧胆酸;每1.5个月进行一次病情监测。该项临床试验的主要终点事件为药物响应者(对比导入期,ALS病情指数的变化斜率改善至少15%)的百分比,次要终点事件包括和安慰剂对照相比较的疗效(ALS病情指数和肺功能等的变化)、应试患者生存期和不良反应等。试验结果显示,牛磺酸熊去氧胆酸可以被应试ALS患者耐受,不良反应在两组之间没有显著差异;主要的不良药物反应均为消化道反应,其发生几率与以往牛磺酸熊去氧胆酸治疗肝胆疾病的临床试验中相仿。在该项III期临床试验的疗效结果中,药物响应者百分比为:服药组87%,对照组43%(P=0.021);在试验结束时,相对基线校正后的ALS病情指数为:服药组23.3,对照组16.3(P=0.007);说明牛磺酸熊去氧胆酸可能延缓ALS患者的病情发展。就ALS病情指数的4个分项:下肢运动、上肢运动和呼吸功能的变化在两组之间没有显著差异;而对于球部功能的病情发展而言,服药组显著慢于对照组。但是肺功能的变化在两组之间没有显著差异。在试验结束后66周的随访结果显示,应试患者的平均生存期为:服药组65.7周,对照组61.1周。经过换算,联合服用利鲁唑和牛磺酸熊去氧胆酸1年可以延缓ALS患者病情发展约4~5个月。该项研究成果于2015年发表在《欧洲神经学杂志》上。从以上两项临床试验的结果来看,牛磺酸熊去氧胆酸对ALS的疗效似乎比熊去氧胆酸更乐观一些。在美国FDA的临床试验数据库中,针对治疗ALS尚没有任何熊去氧胆酸的临床试验做过登记,但是已经登记了4项牛磺酸熊去氧胆酸的临床试验;这么看来,应用牛磺酸熊去氧胆酸治疗ALS的临床研究似乎更活跃一些。这4项临床试验的基本情况如下:1、意大利IRCCS基金会卡洛贝斯塔神经学研究所(上述)2、意大利Humanitas公司试验周期为2019年2月22日至2021年6月30日,试验设计为多地、双盲、随机、平行分组、安慰剂对照、联合使用利鲁唑和牛磺酸熊去氧胆酸的III期临床试验,为上述1的后继临床试验。将有440位应试ALS患者参加,患者要求发病<=1.5年,体重40公斤以上,肺功能>=70%,不使用呼吸机,吞咽无障碍(ALS病情指数分项为满分),服用利鲁唑但不使用依达拉奉,无胆囊疾病。试验方案为3个月的导入期后,每天饭后10~15分钟内服用牛磺酸熊去氧胆酸胶囊2次,每次1克,共服药1.5年;每3个月监测一次终点事件指标,包括响应人数、存活期、ALS病情指数、肺功能等生理指标,及神经纤维水平等分子指标。3、美国Amylyx公司试验周期为2017年6月22日至2019年12月,试验设计为多地、双盲、随机、安慰剂对照的II期临床试验,旨在考察联合使用牛磺酸熊去氧胆酸和苯基丁酸对ALS患者的安全性、以及能否延缓病情的发展。共有132位应试ALS患者参加,患者要求发病<=1.5年,肺功能>=60%,服用利鲁唑与否均可,无胆囊疾病或肝功能低下。试验方案为每天服药2次,每次服用牛磺酸熊去氧胆酸1克和苯基丁酸3克,共服药6个月;检测的终点事件指标包括不良反应、存活期、ALS病情指数变化、肺功能等生理指标,及血液检测和医学影像等细胞分子指标。4、美国Amylyx公司试验周期为2018年3月29日至2020年1月1日;该项临床研究是上述3的后继试验,旨在考察联合使用牛磺酸熊去氧胆酸和苯基丁酸后对ALS患者的长期安全性和疗效,因此试验设计为多地、非盲、单组的II期临床试验。监测对象为上述3中服药的应试患者,检测的终点事件包括长期不良反应、ALS病情指数、肺功能、住院次数、胃造瘘情况和气切情况等。甘氨酸熊去氧胆酸熊去氧胆酸仅占人体总胆酸排出量的4%;前面提到过,熊去氧胆酸在肝脏中被转化为牛磺酸熊去氧胆酸和甘氨酸熊去氧胆酸,而后者的转化量远远大于前者。研究显示,牛磺酸熊去氧胆酸和甘氨酸熊去氧胆酸具有和熊去氧胆酸相同的神经保护作用,因此一个葡萄牙的研究组将治疗ALS的临床前试验聚焦在甘氨酸熊去氧胆酸上。该项研究使用了一个ALS的细胞模型,即过表达人类SOD1G93A突变基因的运动神经元样细胞系NSC-34,而它是由小鼠的成神经细胞瘤细胞和分化自小鼠干细胞的运动神经元杂交而来。体外试验结果显示,当用甘氨酸熊去氧胆酸处理NSC-34时,NSC-34的ALS病理表型发生了变化:细胞质中的SOD1包涵体减少了,线粒体损伤减少了,半胱天冬酶-9的激活及细胞凋亡都下降了;细胞外的硝酸盐浓度下降了,金属蛋白酶-9的激活减少了。这些结果说明甘氨酸熊去氧胆酸可能被用来保护运动神经元、延缓ALS的病情发展。说不定哪天,甘氨酸熊去氧胆酸也和熊去氧胆酸及牛磺酸熊去氧胆酸一起,加入到延缓ALS病情发展的战队中。2019年05月14日 7088 1 4
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王丽平副主任医师 北医三院 神经内科 再次感谢Christian给我们带来的干细胞治疗ALS的信息,希望常在。Christian原创科普:利用人类诱导性多能干细胞(iPSC)筛选治疗ALS的药物一ALS肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种罕见的、迟发的神经退行性病变:大脑和脊髓中的运动神经元由于某种尚不清楚的主要有害因素而遭到破坏并逐渐死亡,因此不能再支配肌肉进行自主运动,进而患者逐渐丧失运动能力,包括由肌肉驱动的语言、吞咽和呼吸能力。1、ALS有多罕见?年发病率约为十万分之1.5,普遍率约为十万分之5。目前的年发病率和普遍率,全球约为12万和35万,欧洲为4988和13500,美国5960和17500,日本约为3000和6000。我国由于医疗体系和医保制度等原因,至今尚无相关的统计数字。2、什么是迟发性?就是起病时间较晚。在欧洲和日本,ALS患者的发病年龄大约在65岁。在我国,北医三院统计发病的平均年龄为49.8岁,中位生存期为5.9年;北京协和医院统计发病的平均年龄约为53岁,实际平均生存期为2.5年。但在80岁后基本不会发病。3、虽然ALS非常罕见,ALS患者的病情却又具有典型的异质性,通俗讲就是五花八门,发病年龄、发病症状、临床表现、发展速度、存活时间、遗传背景等在不同的患者间存在较高的多样性。这就为ALS的临床诊断、基础研究和药物开发提出了极大挑战。4、ALS分为家族性和散发性2种。家族性ALS占总发病率的5-10%,散发性占90-95%。散发性ALS的发病年龄比家族性的小11岁。目前鉴定出和ALS相关的基因突变已有一百多个,已发现导致家族性ALS的突变基因包括C9orf72、SOD1、FUS和TDP-43等,其中C9orf72基因突变占家族性ALS的45%,SOD1占20%。5、值得注意的是,ALS的诊断过程较为复杂、确诊时间较长,通常需要依赖神经科临床检查和问诊、肌电检查、以及对相关一系列病征相近的疾病的排除等间接手段;不像对其他疾病的诊断,可以根据标志物生化指标、和对病灶的医学影像及组织活检等直接证据。同时,ALS具有进行性,早期发展较慢、症状较轻更增加了早期诊断的难度。6、ALS患者的运动神经元在细胞和分子水平上的病理表型包括:因活性氧自由基胁迫或活性谷氨酸毒害等因素导致的细胞死亡、自体免疫反应、神经炎症反应、神经营养因子缺乏、轴突运输缺陷、超兴奋性或低兴奋性、神经肌肉接点功能异常、细胞核质运输功能异常、线粒体功能异常、自体吞噬功能异常、RNA加工错误和蛋白错误聚集等。二iPSC本文题目里的第二个关键词,就是诱导性多能干细胞——iPSC。关于干细胞,我在“干细胞移植技术治疗ALS的临床研究进展”一文中作了比较全面的介绍,在此不再赘述。诱导性多能干细胞(iPSC)是干细胞的一种,它是通过人工启动若干(转录因子)基因的表达或使用化合物分子,诱导体细胞的分化、发育进行重新编程,进而获得的具有类似胚胎早期多能干细胞分子特性、更新能力和分化潜能的一类多能干细胞。多能干细胞可以分化为特异组织的细胞,但是特异组织的细胞可以分化为多能干细胞吗?答案是否定的,除非对充分分化的细胞进行化学或基因表达的诱导。iPSC之父、2012年诺贝尔奖获得者山中伸弥教授通过学习胚胎发育早期的基因表达情况,利用原创的筛选系统,在引入4个转录因子基因的特异性表达后,首次成功地倒转了细胞自然发育的时钟,将皮肤细胞诱导成为具有早期胚胎细胞性质的多能干细胞。那么,iPSC之于ALS,能够有何作用?如果将家族性或散发性ALS患者的体细胞诱导成为iPSC细胞系,它可以帮助:1、解析ALS的致病机理。目前,在ALS中导致运动神经元受损伤的最主要的因素仍未找到,这极大地阻碍了有效治疗ALS的药物和疗法的开发。将iPSC诱导分化成运动神经元(iPSC-运动神经元)及神经胶质细胞等,在保持稳定、清晰的ALS遗传背景下,重塑微观上的病理模型,可以在细胞和分子水平上开展ALS的机理研究。这是iPSC对攻克ALS的宏观作用。在ALS发病后,目前已发现对运动神经元的毒害作用包括:活性谷氨酸积累、氧化胁迫、炎症反应、感染、免疫机制、蛋白错误聚集、神经纤维功能紊乱、激素失调、线粒体功能和RNA加工出错、及轴突运输和神经肌肉接点出现问题等,但这些可能都是下游表型,而不是最上游、最主要的触发因素。这就好似一条凌汛期的大江,如果上游溃坝,下游必将多处受灾;此时即便在下游多方施救,也是事倍功半,不及尽早将上游的大坝修复更有成效。相似地,对于ALS而言,即便对再多的下游表型对症治疗,也是防不胜防,而找到上游起因才是关键。2、找到基因型和表现型之间的对应关系。来自ALS患者的iPSC具有稳定、清晰的基因型;该iPSC-运动神经元是ALS真实、有效的体外病理模型,可以在细胞和分子水平上对其微观表现型进行观察、分析,包括细胞形态、亚细胞结构、生化组成和基因表达等,为确定ALS致病基因型和在运动神经元上对应的表现型之间的关系提供了条件。这一点对散发性ALS的基础研究尤为重要,因为无论是ALS动物模型还是胚胎干细胞系,目前的模式系统都是基于家族性ALS致病基因突变(例如SOD1G93A)的转基因异源过表达。3、发现生物标志物。简单讲,生物标志物就是标记某种生理改变的生化指标;对于ALS而言,可以理解为在患者和健康成人之间,以及在患病运动神经元和健康运动神经元之间存在着某种特异、灵敏而又稳定的差异,这种差异可以被一个易于测量的生化指标所检定和评估,而这个生化指标就是ALS的生物标志物。该iPSC-运动神经元和健康的运动神经元之间经转录组、蛋白组和代谢组比对后,更容易找到针对ALS的生物标志物,进而在ALS的早期诊断、精细分型、病情分期、疗效评估和药物筛选等方面发挥重要作用。4、筛选治疗ALS的药物。这是本文的主要内容,因此将在下面详细展开。实际上对于ALS,iPSC之所以有上述用途,主要是基于以下特点:——丰富的病理模型。前面提到过,虽然ALS非常罕见,从临床上讲却具有高度的异质性;尤其是散发性ALS,相关基因突变也是数量庞大。iPSC最明显的优势就在于,理论上可以为每一位确定的ALS患者建立iPSC系,该干细胞系有着明确的疾病相关性和遗传信息。相比较ALS动物模型,ALS患者的iPSC系可以给ALS研究者提供更加丰富的病理模型。——微观的研究对象。前面提到过,在临床上ALS主要是通过间接方法进行诊断,而ALS的基础研究主要是基于动物模型。相比较,iPSC-运动神经元则可以在体外以细胞为单位进行研究,当分化为运动神经元后更容易实施细胞和分子水平上的观察、检测和实验,这对研究致病机理、分析微观表型、发现生物标记物和高通量地筛选小分子药物都具有非常重要的意义。——多样的分化细胞。iPSC的多能性不容忽视:目前已经可以将iPSC诱导分化为上运动神经元、下运动神经元、脊髓神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经细胞亚型,这样一来就可以研究在ALS的致病机制中,不同神经细胞亚型各自发挥的作用机理,以及不同神经细胞亚型之间的动态和互作关系,甚至可以在体外更好地重现运动神经元的体内环境。iPSC对于ALS研究也不是没有缺点。前面提到过,ALS具有迟发性,而且发病可能还与特殊的生理和环境因素有关;这些和其他ALS病理模型一样,是iPSC-运动神经元无法还原的。另外一点就是,iPSC-运动神经元终究是体外系统,也无法囊括非细胞自主的病理表型,因此任何相关的发现均需与体内试验或ALS患者样本进行交互验证。三利用iPSC筛选治疗ALS药物的总述1、基本流程A、确定iPSC的患者来源。家族性或散发性ALS患者?何种基因型?制备近等基因系对照?B、确定iPSC的诱导方法和运动神经元的分化方法。是否通过细胞分选来提高细胞纯度?C、确定药物筛选的病理表型。细胞死亡或其他表型?能否通过图像采集进行定量分析?D、确定药物筛选的操作平台。一般基于96或384孔板。能否高通量、全自动地进行?E、确定小分子化合物文库。是否为临床上正在使用的、或正在进行临床试验的药物?F、确定数据分析方法。图像采集算法和数据分析方法一般是客制的。G、确定结果验证方法。是否使用更多的ALS基因型?是否筛查更多的病理表型?H、最后决定是否进入临床前或临床试验。2、药物安全性和药效药物的安全性是首要的,不可伤敌八百,自伤一千。小分子化合物对运动神经元的安全性体现在:无论对ALS-iPSC-运动神经元还是对对照-iPSC-运动神经元,都不会导致细胞死亡或导致病理表型的恶化。如果小分子化合物文库是临床上正在使用的、或正在进行临床试验的药物,那么筛选出来的候选药物的安全性通常是有一定保障的,进一步的开发过程通常可以省去很多相关试验——而这部分药物安全性的试验往往是新药开发中最昂贵的部分。至于药效,指药物能否改善ALS病理表型指标,以及改善的程度。四用iPSC筛选ALS治疗药物的开创性研究和腰果酸的发现2007年至2018年间,全球共进行了86项针对治疗ALS的临床试验,其中绝大多数有关小分子药物。这些试验或最终完成,或中途终止,但最终却只有一个药物获得了FDA的批准,即2017年5月获准应用于ALS治疗的依达拉奉。这些小分子在ALS动物模型中都展示了出色的效果,但是当用到ALS患者身上时却总是毫无效果。日本京都大学的山中伸弥和井上治久教授认为,ALS治疗药物开发的成功率极低是因为ALS动物模型并不是适合筛选ALS治疗药物的疾病模型;同ALS患者一样,ALS动物模型中的运动神经元也难以直接进行研究。于是,井上治久研究组先将ALS患者的皮肤成纤维细胞诱导成为iPSC,再将iPSC分化成为运动神经元。这些iPSC-运动神经元具有ALS的分子病理表型,包括较短的轴突和细胞质聚集体等,并且在氧化胁迫下可以更快地凋亡——至此,确定了来自ALS患者的iPSC-运动神经元作为研究ALS的体外细胞模型的可行性。最后,在筛选了4个小分子化合物后,发现腰果酸可以逆转运动神经元的ALS病理表型——至此,确定了来自ALS患者的iPSC-运动神经元作为ALS治疗药物筛选工具的可行性。诱导iPSC的皮肤成纤维细胞采样自带有TDP-43突变基因的家族性ALS患者。TDP-43是一个由414个氨基酸组成的核蛋白,含有的2个RNA识别模序可与细胞核内的mRNA结合。TDP-43参与了RNA代谢的多个步骤,包括mRNA的转录、剪切和运输等。采样患者的皮肤细胞来自3名不同的家族性ALS患者,分别带有Q343R、M337V和G298S等3个不同的TDP-43突变基因,并诱导出9个不同的iPSC系,用以避免因突变或克隆间的个体差异产生的错误。对照(iPSC-运动神经元)来自5个健康成人个体皮肤成纤维细胞诱导出的7个iPSC系。1、ALS患者及对照的皮肤成纤维细胞通过逆转录病毒或游离载体被成功诱导为iPSC,并表达了人类胚胎干细胞的生物标志物。接着,ALS患者及对照的iPSC被成功分化为运动神经元,并表达了运动神经元的生物标志物;当这些运动神经元与肌肉细胞共培养时,可产生正确的自发动作电位和突触电位。TDP-43基因突变并未影响iPSC向运动神经元的分化。2、和对照相比较的细胞和分子表型分析发现,ALS-iPSC-运动神经元:具有较短的轴突长度,这和在ALS斑马鱼模型中的发现一致;具有更低的神经纤维mRNA含量,这和在ALS患者尸检中的发现一致,而且编码细胞骨架中间体纤维的基因的表达量下降,也都与轴突较短的表型相吻合。3、和对照相比较发现,ALS-iPSC-运动神经元:细胞质中出现大量不溶于非离子表面活性剂的包涵体,包涵体内含TDP-43蛋白聚集体,这和在ALS患者尸检中的发现一致;TDP-43和RNA剪切因子SNRPB2的蛋白含量都有增加,并且在细胞核中共定位,这也和在ALS患者尸检中的发现一致;在亚砷酸盐诱导的氧化胁迫下,包涵体中TDP-43的含量增加,细胞存活率显著下降。基于上述2和3,说明ALS-iPSC-运动神经元可作为ALS病理的体外细胞模型。4、TDP-43蛋白可以结合到自身mRNA末端的顺式区域,通过负反馈机制调控自身的蛋白合成。和对照相比较发现,ALS-iPSC-运动神经元中TDP-43蛋白的mRNA含量上升。基因芯片分析结果显示,ALS-iPSC-运动神经元中有关RNA结合、加工、剪切和运输、mRNA加工和剪切、以及核糖体蛋白复合体和RNA剪切复合体的基因表达量的上升最为显著,说明基因转录和RNA剪切功能失调。5、根据上述基因芯片的检测结果,井上治久研究组测试了4种调控基因转录的小分子药物:曲古抑菌素A、spliceostatin A、山竹醇和腰果酸。治疗ALS药物的筛选平台是在用亚砷酸盐诱导氧化胁迫与否的条件下,检测ALS-iPSC-运动神经元和对照-iPSC-运动神经元细胞存活的情况:药物的安全性表现为,当药物处理运动神经元时不会导致细胞死亡;药物的有效性表现为,药物可以防止ALS-iPSC-运动神经元在氧化胁迫下凋亡。筛选结果显示,腰果酸安全且有效,spliceostatin A和山竹醇安全但无效,曲古抑菌素A不安全且无效。6,验证试验的结果显示,在ALS-iPSC-运动神经元中腰果酸可以将TDP-43的mRNA表达量降低147倍,降低包涵体中TDP-43蛋白的含量,并增加轴突的长度;这些结果说明腰果酸可以有效逆转ALS-iPSC-运动神经元的病理表型,是治疗ALS的候选药物,同时也说明ALS-iPSC-运动神经元及相关平台可被用于筛选治疗ALS的小分子药物。该项研究成果于2012年发表在《科学》杂志子刊《科学-转化医学》上,是用iPSC筛选ALS治疗药物的开创性研究。至于腰果酸是否可在临床上用于ALS治疗,原创研究中仅仅筛选了4个候选药物显然是没有什么诚意的,试验结果显示腰果酸也不是非常安全;特别是作为组蛋白乙酰转移酶抑制剂,腰果酸可能涉及的分子生化途径非常广泛,并非是特异的ALS靶向药。因此,该项研究在ALS治疗药物的筛选方面,更倾向于概念验证的性质,而实际上后来腰果酸也没有进入临床试验。五对ALS-iPSC-运动神经元的神经电生理检测和瑞替加滨的发现对ALS致病机理的研究存在着2种假说。第一种是神经兴奋毒性假说,认为过量的谷氨酸突触活性导致了钙离子过载和运动神经元凋亡。第二种是神经超兴奋性假说,认为神经轴突细胞膜的超兴奋性导致了ALS——对运动神经元的电导性研究发现,ALS患者的轴突细胞膜的兴奋性增加,但是远离突触区域,且这种超兴奋性的程度与ALS患者的生存期负相关;轴突细胞膜超兴奋性的产生可能与持续性钠电流的上升或延迟整流钾电流的下降有关。在ALS动物模型(SOD1G93A基因突变)中也发现了运动神经元的超兴奋性。美国哈佛大学医学院的伊根和沃尔夫教授支持神经超兴奋性假说。他们的研究组先将家族性ALS患者的皮肤成纤维细胞诱导成为iPSC,再将iPSC分化成为运动神经元。多电极芯片和膜片钳等神经电生理检测技术记录下了ALS-iPSC-运动神经元的超兴奋性,再现了ALS患者的神经生理学临床表型。这种超兴奋性的产生可能与延迟整流钾电流水平的下降有关;小分子药物瑞替加滨是一种电压门控钾离子通道的激活剂,试验发现它可以抑制这种超兴奋性,并在体外延长ALS-iPSC-运动神经元的存活。该项研究的结果表明,对iPSC-运动神经元的神经电生理检测可被用来验证疾病的临床表型、研究ALS的致病机理以及发现ALS的治疗药物。这项研究主要分为2大部分。第一部分主要是对ALS-iPSC-运动神经元的超兴奋性在神经电生理、细胞和分子等水平上的表型鉴定。1、ALS-iPSC-运动神经元来源自2名无亲缘关系、但都携带相同的SOD1A4V基因突变的家族性ALS患者。对照-iPSC-运动神经元来源自2个健康成人。2、在携带SOD1A4V基因突变的ALS患者与作为对照的健康成人之间,除了SOD1基因存在差异外,在两者的基因组上还存在着非常广泛的单核苷酸多态性;而这些遗传背景上的差异可能对两者运动神经元间表型上的差异造成影响,从而使研究结论产生偏差。为消除这种可能存在的偏差,研究者基于SOD1A4V/+基因型制备了正常(野生型)SOD1+/+基因的近等基因系iPSC;也就是说,突变体和野生型的近等基因系iPSC之间,除了在SOD1基因上的差异外,其他遗传背景几乎完全相同。和一般的健康成人的iPSC-运动神经元相比较,这个野生型SOD1基因近等基因系的iPSC-运动神经元是一个更为严谨的对照。3、为了检测ALS-iPSC-运动神经元以自发放电为表现的兴奋性,研究者使用了2种神经电生理检测技术。第一种技术是细胞外多电极芯片:在每个培养孔中都有64个呈网格状排列的电极,记录着培养孔中每个运动神经元的动作电位。多电极芯片检测结果显示,和对照(包括野生型SOD1基因的近等基因系)相比较,ALS-iPSC-运动神经元产生的自发动作电位显著增加,说明其具有超兴奋性。第二种技术是全细胞膜片钳技术。在响应慢速渐进式去极化的过程中,ALS-iPSC-运动神经元触发的动作电位数量显著高于对照(包括野生型SOD1基因的近等基因系)-iPSC-运动神经元,说明其具有超兴奋性。4、研究者用绿色荧光蛋白GFP标记运动神经元进行多电极芯片检测,用红色荧光蛋白RFP标记运动神经元进行膜片钳检测,以保证实验用细胞类型的准确性。5、用膜片钳技术还可以定量检测出决定神经元兴奋性的特异性电流。电压钳实验结果显示,和对照(包括野生型SOD1基因的近等基因系)相比较,ALS-iPSC-运动神经元的延迟整流钾离子通道减少,进而降低了延迟整流钾流,从而使触发的动作电位增加、导致超兴奋性。第二部分主要是发现瑞替加滨可以作为治疗ALS的候选药物。1、在多种电压门控钾离子通道中,Kv7通道最适合补偿延迟整流钾流、抑制运动神经元的超兴奋性。小分子药物瑞替加滨是Kv7通道阈下钾流的特异性激活剂,也是临床上批准使用的抗痉挛药。全细胞膜片钳实验的结果显示,瑞替加滨可以阻止ALS-iPSC-运动神经元的自发放电。多电极芯片记录的结果显示,瑞替加滨可以在抗癫痫的药理学浓度上阻止ALS-iPSC-运动神经元的自发放电。以上结果说明,瑞替加滨能够抑制ALS-iPSC-运动神经元的超兴奋性。2、当在体外培养时,ALS-iPSC-运动神经元在成熟15天后开始凋亡,且死亡率始终高于对照-iPSC-运动神经元。用瑞替加滨处理14天后,ALS-iPSC-运动神经元的死亡率下降25%,说明瑞替加滨能够延长ALS-iPSC-运动神经元的存活时间,其作用机理与缓解线粒体胁迫有关。3、上述试验结果都是基于携带SOD1A4V基因突变的家族性ALS患者来源的iPSC-运动神经元。为了验证ALS-iPSC-运动神经元的超兴奋性和瑞替加滨的疗效具有普遍性,研究者又针对携带3种不同SOD1基因突变的4名不相关患者的4个iPSC系、携带C9orf72基因突变的2名不相关患者的2个iPSC系和携带2种不同FUS基因突变的2名不相关患者的2个iPSC系进行了研究。多电极芯片记录结果显示,分化自这些iPSC系的运动神经元都具有超兴奋性,并且它们的自发动作电位都可以被瑞替加滨所阻遏。以上结果说明,家族性ALS患者的iPSC-运动神经元在体外具有的超兴奋性以及对瑞替加滨的敏感性都具有普遍性。该项研究成果于2014年发表在《细胞》杂志子刊《细胞-报告》上,首次对ALS-iPSC-运动神经元进行了神经电生理表型鉴定。值得注意的是,ALS的迟发性意味着患者在出生后的数十年后方才起病,然而ALS-iPSC-运动神经元在成熟后的数周后即可再现临床上的病理表型,这可能与ALS-iPSC-运动神经元在体外缺乏神经胶质细胞的支持及抑制性回路等体内环境有关,这也是ALS-iPSC-运动神经元作为病理模型的一个固有的缺陷。至于瑞替加滨是否可在临床上用于ALS治疗,我本人并不看好。首先,ALS运动神经元的超兴奋性仅仅是导致运动神经元凋亡的可能因素之一,而它和细胞凋亡之间的关系也尚不清楚。其次,导致ALS运动神经元超兴奋性的主要原因是持续性钠流,这也是ALS延缓药物利鲁唑所靶向的调控位点;电压门控钾离子通道的贡献位居其次,因此无法期待仅对它的调控就可以非常有效地抑制运动神经元的超兴奋性。最终,运动神经元的超兴奋性可能只是ALS致病机理中偏下游的病理表型,而非最上游、最主要的触发机制,因此对它的调控也许只能起到有限的、延缓病情发展的作用。当然,瑞替加滨作为抗癫痫药已经在临床上使用了多年,其应用在其他神经退行性病变上的安全性是有所保障的。瑞替加滨有关ALS的二期临床试验由葛兰素史克公司和哈佛大学医学院联合开展,已于2015年6月开始,并于2018年2月结束。该项临床试验虽然是以ALS患者为试验对象,但是试验的目的并非是检测和评估瑞替加滨治疗ALS的效果,而是研究瑞替加滨对ALS患者运动神经元兴奋性的作用。该项临床试验采取的主要检测方法是用经颅磁刺激技术检测上运动神经元的兴奋性,以及用神经轴突传导阈值示踪技术检测下运动神经元的兴奋性;并无ALS病情检测的常规内容(例如ALS病情指数、肌力和肺功能等指标),而是仅仅记录应试患者自述的肌肉痉挛情况。相关临床试验结果尚未发表。六用ALS-iPSC-运动神经元进行高通量小分子药物筛选和博舒替尼的发现时隔5年后,日本京都大学的井上治久研究组再度出击,以携带SOD1基因突变的家族性ALS患者为出发点,诱导出iPSC系并进一步分化出运动神经元,并以ALS-iPSC-运动神经元的存活率为衡量标准,对现有的临床药物进行了高通量的筛选。在筛选的1416种药物中,有27种可以在体外提高ALS-iPSC-运动神经元的存活率,其中又有过半的药物靶向Src/c-Abl信号途径。敲低Src/c-Abl的表达,和使用Src/c-Abl抑制剂一样,可以延缓ALS运动神经元的凋亡。其中,Src/c-Abl抑制剂博舒替尼可以在ALS运动神经元中增强自体吞噬,减少突变的SOD1蛋白的错误折叠,对来源于多种基因型的家族性和散发性ALS患者的iPSC-运动神经元可在体外提高其存活率,并可在体内延长ALS小鼠的存活期,因此是治疗ALS的候选药物。Src和c-Abl是在人体内广泛存在的、非受体性的酪氨酸激酶,其编码基因与病毒编码的致癌基因同源。Src的激活与细胞增殖、凋亡、侵染和血管生成相关,并参与肿瘤形成,因此成为了肿瘤治疗的靶标。c-Abl的融合蛋白具有致癌性,可导致慢性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病,因此c-Abl的抑制剂已被开发成为治疗慢性髓性白血病的药物。Src/c-Abl还参与了多种神经退行性病变的致病过程,该项研究发现它们也参与了ALS的致病过程。这项研究主要分为2大部分。第一部分主要是用ALS-iPSC-运动神经元建立ALS治疗药物的高通量筛选平台,并用该平台发现了博舒替尼。1、作为对照的健康成人和携带SOD1L144FVX基因突变的家族性ALS患者的皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞被诱导成iPSC系;ALS-iPSC系经CRISPR-Cas9基因编辑后,被校正为含有(正常的)野生型SOD1基因的近等基因系iPSC,并和来自健康成人的iPSC系一起作为对照。2、上述iPSC系被分化成运动神经元,并成功表达了运动神经元的生物标志物;这些iPSC-运动神经元可与人类成肌细胞形成神经肌肉接点,并具有神经电生理活性。ALS-iPSC-运动神经元中含有突变的SOD1蛋白经错误折叠后形成的聚集体;和对照相比较,ALS-iPSC-运动神经元具有较低的细胞存活率,而其存活率的变化后面被用作筛选ALS治疗药物的主要指标。3、高通量药物筛选的方案:将单细胞的iPSC放置在96孔板的培养孔中诱导分化,7天后可发育成运动神经元;此时在每个培养孔中相应加入候选的小分子药物后继续培养,在第二个7天后进行固定和微管蛋白免疫染色;之后利用IN 6000型细胞分析仪对存活的运动神经元进行自动化、高通量的图像捕捉和统计分析。已知可提高ALS-iPSC-运动神经元存活率的肯帕罗酮被用作候选小分子药物的正对照,载体溶剂DMSO被用作负对照。尽管ALS患者的病情具有高度的异质性,ALS的细胞和分子表型以及致病机理的假说也多种多样,但是运动神经元的凋亡是所有ALS病例共同的病理特征。因此,使用ALS-iPSC-运动神经元的存活率作为药物筛选的评价指标是最为稳妥的思路。4、待筛选的小分子药物文库包含有1416种化合物,均为目前临床上正在使用的、或正在进行临床试验的药物。经筛选,其中有27个化合物可以显著提高ALS-iPSC-运动神经元的存活率,而其中的14个化合物均靶向Src/c-Abl信号途径。最终,研究者聚焦在了博舒替尼,并着手进行下一步的深入研究,因为博舒替尼可以直接抑制Src/c-Abl,作用浓度低,具有剂量依赖性(效果随剂量的增加而逐渐提高),且没有细胞毒性。第二部分主要是验证博舒替尼的作用,及用其治疗ALS的分子机理。1、通过RNA干扰技术敲低ALS-iPSC-运动神经元中Src或c-Abl的表达后,ALS-iPSC-运动神经元的存活率上升,暗示着博舒替尼对Src/c-Abl的抑制可以延缓ALS运动神经元的凋亡。2、ALS-iPSC-运动神经元在体外的细胞和分子病理表型、以及博舒替尼的相关作用如下:A、西部印记实验和酶联免疫吸附测定结果显示,Src/c-Abl的磷酸化水平升高,博舒替尼可降低其磷酸化水平;B、蛋白标志物检测结果显示,细胞的自体吞噬紊乱,博舒替尼可将其恢复到近正常水平;博舒替尼对ALS-iPSC-运动神经元的保护作用可被自体吞噬抑制剂所阻断,说明博舒替尼的保护作用可能与增加自体吞噬过程有关;C、西部印记实验结果显示,突变SOD1蛋白的错误折叠增加,博舒替尼可降低错误折叠;D、细胞内ATP含量降低,博舒替尼可提高细胞内ATP含量;与卡尔文循环和呼吸电子传递链相关的基因的表达量上升,博舒替尼可降低其表达量,说明它可以恢复细胞的能量平衡。以上结果说明,ALS-iPSC-运动神经元在体外具有ALS的病理表型,并可被博舒替尼逆转。3、上述试验结果都是基于携带SOD1L144FVX基因突变的家族性ALS患者来源的iPSC-运动神经元。研究者又测试了2种不同SOD1基因突变、3种不同TDP-43基因突变、3种不同C9orf72基因突变和3名散发性ALS患者的iPSC系。测试结果显示,博舒替尼可以延长所有这些iPSC-运动神经元的体外存活时间,并且减少它们因蛋白错误折叠而产生的聚集体。以上结果说明,博舒替尼延长运动神经元体外存活时间的作用对家族性和散发性ALS患者具有普遍性。4、上述试验结果都来自博舒替尼对ALS-iPSC-运动神经元的体外实验。Src/c-Abl抑制剂的体内试验结果显示,当博舒替尼通过腹腔内注射进入ALS小鼠体内后,轻微延缓了小鼠的ALS发病时间约10.8天,并延长了小鼠的存活期约7.8天。博舒替尼在ALS小鼠体内降低了Src/c-Abl的活性、减少了脊髓内突变的SOD1蛋白的错误折叠、并增加了运动神经元的存活数量。以上结果说明,在体内博舒替尼对Src/c-Abl的抑制延缓了ALS运动神经元的退行性病变。该项研究成果于2017年发表在《科学》杂志子刊《科学-转化医学》上,是利用ALS-iPSC-运动神经元对ALS治疗药物进行高通量筛选的经典案例。2019年3月28日,日本放送协会(NHK)报道了日本京都大学井上治久研究组宣布开始进行博舒替尼治疗ALS的临床试验。该临床试验将在京都大学附属医院等4家医疗机构开展,募集最多24名应试患者;这些应试患者将首先连续12周服用该药,以确认药物的安全性。到目前(2019年4月21日)为止,该项临床试验尚未在美国FDA登记。用治疗慢性髓性白血病的临床药物博舒替尼治疗ALS至少有2个优势:首先,既然博舒替尼已经在临床上获得应用,说明其用药安全性是有保障的;另外,博舒替尼是用提高ALS运动神经元的体外存活率作为指标筛选出来的,该指标直指ALS最基础、最核心的病理表型——运动神经元的凋亡;由此可见,博舒替尼治疗ALS的作用机理能够切中要害,而不像瑞替加滨,首先针对的是降低运动神经元的超兴奋性。至于博舒替尼最终是否可在临床上用于治疗ALS,还要看其临床试验的疗效结果。在最初筛选出的Src/c-Abl抑制剂中,博舒替尼在体外的效果并非最好,但是它具有剂量依赖性,并且可以直接抑制Src/c-Abl,因此最终被研究者选出。博舒替尼在ALS小鼠模型(SOD1G93A)中的体内实验也是战绩平平,也因此研究者在论文中认为临床转化博舒替尼时机尚不成熟,但这和它对ALS-iPSC-运动神经元(SOD1G93A)的体外实验的结果一致。博舒替尼能够缓解线粒体逆境胁迫的病理表型也不具有普遍性:在家族性ALS患者中,该表型只存在于携带SOD1和C9orf72基因突变的患者中,而不存在于携带TDB-43和FUS基因突变的患者中。然而,博舒替尼对来源自C9orf72基因突变的家族性ALS患者和散发性ALS患者的iPSC-运动神经元的体外实验战绩不俗,说明博舒替尼在治疗ALS时潜在的应用范围可能还比较广泛。七利用iPSC筛选ALS治疗药物的其他研究以上详细介绍了3项有关利用iPSC筛选ALS治疗药物的研究,第一项是该领域的开创性工作,另外两项也都筛选出了进入临床试验的药物。利用iPSC筛选ALS治疗药物还有其他很多项研究,下面按时间顺序简要介绍一下这些研究的成果。1、2013年,《细胞-干细胞》,美国哈佛大学筛选用的运动神经元来自健康小鼠和ALS小鼠(过表达人类SOD1G93A突变基因)的胚胎干细胞系——没错!这里没有使用人类ALS患者的iPSC系。通过在细胞培养中戒断营养因子的供应来诱导运动神经元凋亡,再加入候选药物,观察其能否延长运动神经元的生存。筛选过程在384孔板上以高通量、全自动的方式进行;以具有抗细胞凋亡作用的蛋白合成抑制剂放线菌酮为正对照,共筛选了约5000个化合物和生物活性物质,结果发现神经保护因子、具有抗细胞凋亡作用的蛋白或DNA合成抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、钙蛋白酶抑制剂、大麻素受体激活剂、靶向钙离子通道的神经递质受体配基和包括肯帕罗酮在内的激酶抑制剂等可延长运动神经元的生存。肯帕罗酮还能够减少突变的SOD1蛋白的聚集,但不改变运动神经元轴突和突触的形态和神经电生理功能。尽管在筛选过程中使用的是小鼠胚胎干细胞来源的运动神经元,但是在验证过程中使用了携带SOD1和TDP-43基因突变的家族性ALS患者来源的iPSC-运动神经元,并且发现肯帕罗酮可以延长后者的生存。2、2013年,《分子和细胞神经科学》,美国iPierian公司ALS-iPSC-运动神经元来自8名家族性和16名散发性ALS患者,并被精细分化为上-和下-运动神经元;当与星形胶质细胞共培养时,可较快产生神经电生理特性。早期研究结果显示,在全部散发性ALS患者和非SOD1基因突变的家族性ALS患者的运动神经元内都发现了TDP-43聚集体,说明该病理表型具普遍性,并出现在其他神经退行性病变中。在本项研究中,研究者在3名散发性ALS患者的ALS-iPSC-运动神经元中也发现了TDP-43聚集体:这些聚集体位于细胞核内,被高度磷酸化但未被泛素化;这些病理表型与其中1名患者的尸检结果一致。由此,研究者以TDP-43核内聚集体为筛选指标,观察候选药物能否抑制TDP-43聚集体的产生。筛选过程在384孔板上以高通量、全自动的方式进行,共筛选了1757个化合物,结果发现4大类的38个化合物可减少TDP-43核内聚集体:CDK激酶抑制剂(肯帕罗酮同类)、JNK激酶抑制剂、雷公藤甲素和FDA批准临床使用的强心苷(地高辛、毛花苷C和原海葱苷A)。强心苷是钠/钾泵抑制剂,能够改变钙离子流、提高细胞内ATP含量,而且具有神经保护作用、能够抑制SOD1聚集体的产生、以及防止多聚谷氨酸诱导的细胞死亡。3、2013年,《科学-转化医学》,美国Cedars-Sinai医学中心六核苷酸GGGGCC重复在C9orf72基因的非编码区(启动子或内含子等)的扩增导致了45%的家族性ALS和10%的散发性ALS的发生,并与阿尔茨海默病和帕金森症等其他神经退行性病变的发生相关。然而,该重复的扩增是C9orf72基因的功能缺失性突变还是功能获得性突变尚无定论。对来自4名携带C9orf72基因突变的家族性ALS患者的ALS-iPSC-运动神经元进行研究发现,该基因的表达量并未下降,敲低其表达量后对细胞也无毒害作用;然而六核苷酸重复的转录却上升了,并形成可能改变RNA代谢的RNA聚集体,同时。靶向C9orf72基因的反义RNA可以抑制RNA聚集体的形成,并逆转基因表达谱的改变,进一步证明了六核苷酸GGGGCC重复的扩增是该基因的功能获得性突变。反义RNA目前主要作为一种负向遗传学手段应用于对基因的功能研究,研究者也未调查该反义RNA对ALS运动神经元病理表型的作用。不同于小分子药物,反义RNA用于人类疾病治疗的技术尚不成熟。因此对于ALS而言,该反义RNA对基础研究的意义远大于临床治疗。4、2013年,《神经元》,美国约翰霍普金斯大学对来自4名携带C9orf72基因突变的家族性ALS患者的ALS-iPSC-运动神经元进行研究发现:六核苷酸GGGGCC重复在细胞核内形成RNA聚集体;运动神经元的基因表达谱发生改变;能够与六核苷酸GGGGCC重复相互作用的RNA结合蛋白ADARB2数量减少;ALS-iPSC-运动神经元对谷氨酸介导的神经兴奋毒性的敏感度上升100倍。这些病理表型与ALS患者的尸检结果一致。接着,研究者构建了250多种与C9orf72基因不同区段的序列互补的反义RNA,且从中筛选出不减少C9orf72基因的表达量、但可以与六核苷酸重复序列相结合并解除其与RNA结合蛋白相互作用的反义RNA。这些反义RNA可以在体外逆转ALS-iPSC-运动神经元的上述病理表型,包括可以提高其受到谷氨酸胁迫时的存活率。该项研究同样证明了六核苷酸GGGGCC重复的扩增是C9orf72基因的功能获得性突变,即获得了RNA毒性。尽管这些反义RNA在体外可以延长ALS运动神经元的生存,但是鉴于反义RNA用于人类疾病(尤其是中枢神经系统的疾病)治疗的技术尚不成熟,因此对于ALS而言,这些反义RNA对基础研究的意义远大于临床治疗。5、2015年,《自然》,美国约翰霍普金斯大学在果蝇中,仅仅六核苷酸GGGGCC重复本身就能引发运动神经元的退行性病变;细胞核质运输的调节因子RanGAP是其抑制子,可以抑制六核苷酸重复的神经毒性,而增强入核运输也可起到同样的作用。在携带C9orf72基因突变的家族性ALS患者的ALS-iPSC-运动神经元中,六核苷酸重复可以与人类的RanGAP同源蛋白相结合并破坏后者的功能,使核蛋白无法从细胞质向细胞核内运输,而靶向六核苷酸重复的反义RNA则可以恢复正常的入核运输。在果蝇中,卟啉化合物TMPyP4可以解除六核苷酸重复和RanGAP之间的结合,从而恢复正常的入核运输;核输出蛋白1抑制剂KPT-276在抑制出核运输的同时,也可补偿入核运输的缺陷。TMPyP4和KPT-276都可以抑制六核苷酸重复引发的运动神经元退行性病变。TMPyP4和KPT-276并未在ALS-iPSC-运动神经元中进行测试,而反义RNA也未在ALS-iPSC-运动神经元中测试其对存活率的影响。这3者在该项研究中的作用,还主要是针对理论验证,证明六核苷酸GGGGCC重复通过对细胞核质运输的抑制来引发运动神经元退行性病变。6、2015年,《自然-通信》,美国威斯康辛大学针对当前将人类多能干细胞分化成运动神经元时效率低和纯度差等问题,张素春研究组改进了方法,通过化学小分子调控多条信号途径,最终在28天内可将人类胚胎干细胞分化成为大量的、高纯度(>90%)的、功能完好的成熟运动神经元;该方法也适用于人类iPSC。在ALS中受损伤的脊髓运动神经元位于脊髓前角,并将轴突伸向肌肉细胞以指挥其运动,轴突变短是ALS的病理表型。研究者用荧光素酶标记轴突,以轴突长度的变化作为表型指标就可以高通量、全自动地筛选ALS治疗药物。利用新的运动神经元分化方法,先导性验证试验发现肯帕罗酮和EphA抑制剂可以促进ALS-iPSC-运动神经元轴突的生长,但是利鲁唑则不行。携带SOD1D90A基因突变的星形胶质细胞能够抑制ALS-iPSC-运动神经元轴突的生长,经基因校正后的野生型SOD1近等基因系来源的星形胶质细胞则不会。试验结果显示,肯帕罗酮、EphA抑制剂和利鲁唑都不能解除SOD1D90A星形胶质细胞对ALS-iPSC-运动神经元轴突生长的抑制。该项研究除了建立用人类iPSC分化出运动神经元的新方法外,还验证了以运动神经元轴突长度为表型指标建立高通量、全自动的筛选平台用以发现ALS治疗药物的可行性7、2017年,《自然-通信》,比利时VIB脑科学和疾病研究中心ALS通常由患者肢体的远端起病;由于控制肢体远端肌肉的运动神经元具有更长的轴突,因此有假说认为轴突运输缺陷导致了ALS。携带FUS基因突变的家族性ALS患者的皮肤成纤维细胞被诱导成iPSC;ALS-iPSC经CRISPR-Cas9基因编辑后被校正为含有野生型FUS基因的近等基因系iPSC,并和来自健康成人的iPSC一起作为对照。ALS-iPSC-运动神经元在体外具有典型的FUS蛋白亚细胞定位错误、低兴奋性和轴突运输缺陷。移动性的线粒体或内质网囊泡经染色标记后进行成像和分析,用以定量测定其沿轴突运输的数量:在ALS-iPSC-运动神经元中的数量显著降低,说明轴突运输存在缺陷。组蛋白去乙酰酶HDAC6具有微管蛋白去乙酰活性,Tubastatin A和ACY-738可特异性地抑制该活性。在ALS-iPSC-运动神经元中,2个HDAC6抑制剂可以减少微管蛋白的乙酰化,并恢复正常的轴突运输。尽管Tubastatin A和ACY-738可以通过抑制HDAC6来逆转ALS运动神经元轴突运输缺陷的病理表型,但是2个抑制剂至今并未进入临床试验。8、2018年,日本庆应义塾大学,盐酸罗匹尼罗2018年12月3日,日本共同社报道了日本庆应义塾大学冈野荣之研究组宣布开始进行盐酸罗匹尼罗治疗ALS的I/IIa期临床试验,用以评估其安全性和疗效。该研究组利用iPSC技术筛选了1232种目前临床上正在使用的药物,并从中发现目前用于治疗帕金森症的药物盐酸罗匹尼罗能够在体外改善ALS-iPSC-运动神经元的病理表型,包括神经轴突缩短、线粒体功能障碍、蛋白质异常聚集、氧化应激加剧和细胞凋亡增加等。在该项研究中,iPSC来源自ALS患者的外周血细胞;在筛选获得治疗ALS的候选药物中,盐酸罗匹尼罗可通过血脑屏障并具有较小的副作用,而且不仅对(除SOD1基因突变外的)家族性ALS患者、对大约70%的散发性ALS患者也可能有效。相比较利鲁唑和依达拉奉,预计盐酸罗匹尼罗有其2~3倍的疗效,即延长ALS患者的存活期可达半年。将有20名应试ALS患者(20~80岁,发病不超过5年,ALS病情指数在24分以上,肺功能在70%以上,住所距离医院较近,可疑、可能或确定的轻度ALS患者:基本可以做家务和工作、或能独立进行日常生活)参加该项临床试验,并将服用盐酸罗匹尼罗片剂半年。继京都大学和庆应义塾大学分别针对骨骼疑难病症和听力障碍后,这是日本国内第三例利用iPSC技术筛选出的药物进行的临床试验,也是全球首例针对ALS的iPSC发现新药的临床试验。盐酸罗匹尼罗是英国葛兰素史克公司根据多巴胺结构研发的多巴胺受体激动剂,并作为治疗帕金森症的药物于1996年通过审批。不仅是II型多巴胺受体激动剂,盐酸罗匹尼罗还在动物模型中显示出抗氧化作用、促进产生神经营养因子及促进神经干细胞繁殖等神经保护作用,因此可望延缓ALS患者病情的发展,但不会使ALS停止发展、病情逆转或被治愈。早先的研究结果显示,可转化为多巴胺的多巴丝肼对ALS无效。冈野荣之研究组并未发表其ALS-iPSC-运动神经元的筛选平台,也未发表盐酸罗匹尼罗治疗ALS的验证试验。以上信息主要来自新闻报道。该项临床试验也未在美国FDA登记。因此,本文未能就此项研究做详细介绍。八利用iPSC筛选治疗ALS药物的总结早期的ALS治疗药物的筛选和临床前试验,都是以过表达人类SOD1突变基因的小鼠或大鼠为病理模型展开的。尽管携带SOD1基因突变的家族性ALS患者仅占ALS患者总数的1~2%,也就是说其发病率只有千万分之1~2,但是由于该致病突变发现较早,又有动物模型,因此在相当长的时间里被广泛应用在ALS的基础研究和药物筛选中。和ALS动物模型相比较,ALS-iPSC-运动神经元具有以下优势:A、人类细胞;B、来自真实的ALS患者,包括那些在遗传学上尚未发现致病基因的散发性ALS患者;C、可以将ALS的病灶——运动神经元从复杂的生理结构中剥离出来,单独进行研究;D、在细胞和分子水平上可重现生理和解剖水平上的病理表型,并以此进行表型筛选;E、体积小、纯度高、同步性好、重复性好、可以大量扩增,适合高通量的药物筛选。不难想象,以ALS-iPSC-运动神经元为筛选平台及验证模型,将成为今后ALS治疗药物发现和临床前试验的“标配”,也将在ALS的基础研究和生物标志物发现中发挥重要作用。最后总结一下,利用iPSC筛选治疗ALS药物的重点在以下4方面:1、ALS-iPSC-运动神经元的来源家族性ALS患者的来源具有以下3个优势:A、致病的基因突变明确;B、细胞和分子表型清晰;C、相关的研究结果丰富。因此,目前仍是用于ALS治疗药物筛选的首选。家族性ALS患者的来源在具体使用上具有以下2方面的趋势:A、同时使用多种家族性ALS的遗传背景,包括SOD1、C9orf72、TDP-43和FUS等基因突变,同时使用同一基因突变的多个患者来源,以及同时使用一个患者来源的多个iPSC系;B、通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,将ALS-iPSC中的突变型基因校正为野生型基因,制备近等基因系iPSC,并和来自健康成人的iPSC一起作为对照。散发性ALS占90~95%的患病比例,也是用iPSC技术筛选ALS治疗药物最大的优势之一。至少在药效验证阶段,应该使用多个散发性ALS患者的来源,以确保候选药物的广谱性。2、ALS-iPSC-运动神经元用于药物筛选的病理表型A、运动神经元死亡是最具有普遍性和代表性的病理表型,其鉴定方法也相对简单。当然,运动神经元死亡也分为发育中的自然凋亡、去掉营养因子后诱发的死亡、以及添加胁迫因子后诱发的死亡等不同的方式。考虑到ALS实际发病具有迟发性(患者在出生后的数十年后方才起病),以及运动神经元实际上在体内处于被神经胶质细胞支持等更加复杂的生理环境中,因此运动神经元在体外短期内的死亡过程也未必能如实还原在体内对应的病理表型,而找到更接近运动神经元在体内衰老过程的体外诱导方法也是目前该领域亟待解决的一个问题。B、比较具有普遍性的病理表型还包括TDP-43聚集体的产生和运动神经元兴奋性的变化等。而细胞骨架结构异常、细胞核质运输缺陷、线粒体功能异常、内质网胁迫、RNA代谢异常和聚集体的产生、轴突长度变短和轴突运输缺陷等病理表型可能只与个别ALS遗传背景相关,因此上述研究中但凡使用了这些病理表型进行的药物筛选,选出的小分子化合物可能对ALS患者并不具有普遍的适用性。C、ALS-iPSC-运动神经元用于药物筛选的病理表型,无疑是决定筛选成功与否的最重要的因素。其间,各种病理表型在筛选成本上也存在较大的差异;使用多种表型指标可以提高筛选的准确性,但也会显著地增加筛选的成本。在筛选阶段使用细胞存活率外加一个普遍性、特异性的病理表型指标,在验证阶段则综合使用多个病理表型进行筛查,可以在控制成本的前提下提高ALS治疗药物筛选的成功率。3、ALS-iPSC-运动神经元用于药物筛选的试验平台A、常用的96孔板或384孔板系统,不仅可用于运动神经元的培养,而且可与一般的小分子化合物文库对接,还适合高通量、全自动的移液和图像采集。B、利用共聚焦显微镜进行荧光成像是最通用、也是最简单的成像方式,因此对ALS-iPSC-运动神经元病理表型的指标鉴定和定量测量应尽量使用这个技术。图像信号通常来自自发荧光(例如GFP或RFP)、荧光染色(例如荧光免疫杂交)或荧光显色(例如荧光素酶反应)。相反,对运动神经元进行高通量的神经电生理测定就需要相对复杂的仪器设备(例如多电极芯片),尽管神经电生理测定是对成熟运动神经元的功能最准确、最标准的检测和评估方法。C、iPSC除了具有人类真实的ALS遗传背景外,另一个不容遗弃的优势就是多能性。iPSC不仅可以分化成运动神经元,还可以分化成具有相同基因型的神经胶质细胞;将两者共培养,可以在体外为运动神经元提供一个更接近体内真实生理环境的发育条件,而在该条件下对运动神经元进行的药物筛选也将获得更加准确的结果。4、药物筛选使用的小分子化合物文库由于本文综述的几项研究或者主要着眼于基础理论的发现,或者对ALS治疗药物的筛选平台进行概念验证,因此这几项研究或者仅用了少数几个特异性的抑制剂,或者仅筛选了体量较小的化合物文库。如果筛选的化合物文库是目前临床上正在使用的药物,那么从中发现的候选的ALS治疗药物的作用机理已经比较明确,也利于在细胞和分子表型上进行实验验证;同时,其用药安全性也是有保障的,加之可以走孤儿药登记的绿色通道,一旦有效其市场化的进程将会是非常快捷的。对于筛选超大体量的小分子化合物文库,则应等待ALS致病机理取得突破性进展后再行展开——对引发疾病的最上游、最主要的代谢或信号途径进行大规模的抑制剂筛选才最有效。鉴于ALS是非常罕见的疾病,其治疗药物的市场容量很小,届时希望能有富有社会责任感、富有人文关怀精神的大型制药企业站出来承担这项成本高昂的筛选工作。结束语2016年,全球ALS药物的市场体量约为5300万美元;预计到2021年,全球ALS药物及疗法的市值将增至4.68~8.40亿美元之间,并将节省出更多的健康护理费用——仅在美国,2017年的ALS的患者看护费用就高达60亿美元。可见,新的ALS治疗药物市场前景广阔,又有孤儿药资格的绿色通道助力,更是ALS患者期待已久的福音。早先ALS治疗药物的筛选是建立在ALS动物模型的试验基础上,而当用于ALS患者身上时,或是因为意想不到的毒副作用,或是因为疗效不佳,致使在过去10年里进行的80多项临床试验几乎全军覆没。利用iPSC筛选治疗ALS药物是革命性的技术,必将改写该领域的格局,并加速更安全、更高效的ALS治疗药物的发现。ALS-iPSC-运动神经元还可以帮助研究者更快地解密ALS的核心致病机理,而只有靶向ALS致病的最上游、最主要的代谢或信号途径开发治疗药物,才是最根本、最有效的。可是谁又知道呢?不管黑猫白猫,能抓到耗子就是好猫。不过对于已经患病的ALS患者,想要减缓病情的发展或者停止病情的发展,可以靠小分子药物;但是想要逆转病情的发展或者根本上治愈,最终还要依靠干细胞治疗技术——而后者,也将是iPSC可以大显身手的战场。再次感谢Christian给我们带来的干细胞治疗ALS的信息,希望常在。2019年05月03日 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2019年04月03日 7403 13 21
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2016年07月22日 2904 1 0
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姚晓黎主任医师 中山一院 神经科 ALS患者常伴有营养不良,其原因可能包括吞咽困难、肢体无力及患者心理因素导致食欲下降、进食减少,使得能量摄入不足;疾病导致机体代谢率增高、能耗增高。营养不良会使患者病情进展加快,因此,加强营养支持在ALS患者治疗中尤为重要。当患者延髓肌肉受累时,会引起吞咽困难、饮水呛咳,不少患者会有流涎、流鼻涕等情况。当ALS患者出现咀嚼和吞咽问题时,应改变食谱,建议患者少食多餐、进食软食(比如烂饭、米糊等)、非流食(如避免汤等,因进食液体易引起呛咳),必要时可使用增稠剂将液体调成糊状以增加水分摄入量,并避免食用刺激性食物。选择合适的体位进食,进食应小口、缓慢,避免食物误吸入肺内引起窒息或肺炎,进食后保持坐位半小时以避免食物返流、呛咳。有条件的患者可接受吞咽训练等适当的康复治疗,可一定程度上缓解吞咽困难、流涎等症状,具体可咨询康复科医师。受流涎症状困扰的患者,注意调整头的位置(低头时流涎加重,吞咽困难时仰头易引起呛咳),并有意识地锻炼用一定力量闭口,对控制流涎有一定帮助,必要时可在神经科医师指导下服用少量阿米替林减少唾液分泌,改善症状。流鼻涕的患者可用热水蒸汽熏蒸鼻子,以减轻症状。当以上均不能这些措施仍不能保证患者摄取足够的营养,患者出现进行性吞咽困难、体重加速下降、脱水、呛咳导致进餐过早停止时,应尽早使用营养供给装置为患者人工补充足够营养。经鼻腔置入鼻饲管一般为患者提供2-3周的营养支持,并且对患者造成鼻咽部刺激感,患者感觉不舒服,也容易引起反流、误吸。对于需长期人工补充营养的ALS患者,我们建议采用更方便、更安全的胃造瘘管。经皮内镜胃造瘘术(PEG),指在胃镜引导下,在患者上腹部经皮穿刺留置胃饲管,可经造瘘管注入食物及水分,从而能补充营养,保证足够的能量和液体摄入,对于延长ALS患者生存期和改善生活质量有作用。此外,PEG本身的操作相对简单,风险和创伤不大,有经验的医师可将风险控制在极低的几率内。经皮内镜胃造瘘术由专业的消化科内镜医师进行操作,由于ALS患者吞咽困难通常伴随着呼吸功能下降,当呼吸功能下降时,行PEG操作风险将加大,因此我们建议患者如果出现进行性吞咽困难,应尽早行手术。许多患者及家属对手术操作存有恐惧,误以为PEG会对以后的生活带来很大不便,其实PEG术后患者不仅可保留现有的吞咽和说话能力,可依旧经口进食,也不妨碍运动和洗澡,出门时穿上衣服也不会因为腹部造瘘口影响外观。而且由于营养状态的保证,对于以上日常生活能力的保持有很大帮助。关于术后胃造瘘口的护理,家属需要注意的是每次经造瘘管喂食后注入清水,避免造瘘管堵塞;保持造瘘口清洁干燥,避免造瘘口感染;观察造瘘管有无移位等。一般护理得当的情况下造瘘口感染情况并不多见,如果出现造瘘口发红、肿胀、疼痛、液体渗出等感染症状,尽快到医院就诊,予抗感染、局部换药等处理。2014年10月27日 8117 0 2
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鲁明主任医师 北京朝阳医院 神经内科 如前一篇文章所述,窄义的“运动神经元病”(MND)指“肌萎缩侧索硬化”(ALS),因此这里所说的治疗指的是ALS的治疗。西医对任何疾病治疗的基本思路是明确病因和发病机制,针对其病因和发病机制进行治疗。例如细菌性肺炎的病因是细菌感染,因此其基本的治疗原则就是抗生素杀灭细菌。而ALS的发病机制并不明确,这也就是目前西医无确切的有针对性的治疗的根本原因。虽然发病机制不清,但通常认为其共同的病理过程包括“氧化损伤”、“兴奋性氨基酸毒性作用”、“线粒体功能障碍”等。目前的治疗也是针对这几方面进行。利鲁唑(力如太)是一种兴奋性氨基酸拮抗剂,针对的是“兴奋性氨基酸毒性作用”这一机制,这也是迄今为止唯一经过临床验证可以延缓ALS进展的药物。1994年,Bensimon G在著名的“新英格兰医学杂志”发表了第一篇有关利鲁唑治疗ALS的小规模随机双盲对照研究。结果显示,利鲁唑组患者肌无力发展速度明显变慢,用药1年后的生存比例更高,其中球部起病的患者获益更大。1996年,两项大规模临床试验的结果在“Neurology”上公布,结果均显示,利鲁唑可适当延长患者生存期。同年,“Lancet”上的另一篇研究比较了不同剂量利鲁唑的效果,结果显示,100mg/d的剂量最有效,同时患者耐受性最好。50mg/d的剂量也有效,但不如100mg/d好,而200mg/d的副作用太大,患者难以耐受。近20年来,不断有基础和临床研究验证,利鲁唑可适当延缓患者生存期。但它的效果只限于使病情发展减慢,而不能使病情逆转,也很难使病情停止发展,也不能使患者力量恢复。这一点,在服药之前一定要非常清楚。由于此药较贵,我们建议,如果患者经济条件允许,可使用100mg/d的剂量(50mg/次,2次/天),在服药前后1小时不宜服用其他药物或食物。如经济条件不好,可使用50mg/d的剂量(25mg/次,2次/天)。各项研究均显示,本药越早使用,效果越好,对于已发展至晚期的患者,不再建议使用。因此,早期诊断、早期治疗非常关键。利鲁唑可能会导致少数患者的肝功异常,因此在服药后1个月要检测肝功,以后也要定期复查。如果肝功超过正常上限3倍,不建议继续使用。此外,少数患者服药后肌无力反而明显加重,这部分患者也不宜继续使用。对于因各种原因无法服用利鲁唑的患者,可以使用大剂量“维生素C+维生素E+辅酶Q10+左卡尼汀”。大剂量维生素C和维生素E是强抗氧化剂,针对的是“氧化损伤”机制,而“辅酶Q10+左卡尼汀”是线粒体功能保护剂,针对的是后一种机制。这一复方组合理论上是有效的,但未经过临床验证,优点是价格便宜,副作用小,患者耐受性良好。除了药物,ALS患者还有两点需要特别注意,那就是保障营养供应和氧供,这两点的作用甚至比药物更为重要。ALS是高消耗疾病,一旦出现营养不足或氧供减少,病情会迅速进展。因此,患者平时的饮食以高热量高蛋白为主,不要食用味精鸡精及各种鲜味剂,不要服用“降脂药”。要保证体重不降低甚至略有增加。如果患者体重较发病前降低超过10%,或吃饭时间超过30分钟,要考虑进行“胃造瘘”手术,胃造瘘即是通过胃镜在腹壁上留置管道,通过造瘘口进食。虽然听起来较恐怖,但实际操作和护理并不复杂,患者平时也不会有明显不适,只是洗澡受些影响。留置的造瘘管每年更换一次即可。患者病情发展到一定程度,会出现憋气、气短等症状,此时,要进行“肺功能”检查,如FVC值小于75%,要考虑使用“无创呼吸机”。有的患者询问吸氧能否解决问题,答案是否定的。ALS患者主要是由于呼吸肌的无力,导致气体不能吸入及呼出肺部,此时吸氧并不能使氧气进入肺部。而无创呼吸机可以帮助患者增加吸气和呼气的幅度、深度,从而来完成气体交换。由于患者呼吸均有问题,因此一定要选择双水平无创呼吸机。开始可每天使用1小时,待患者耐受后逐渐增加使用时间和频率。利鲁唑、保证营养供应(胃造瘘)、保证氧供(无创呼吸机)是已被证实可延缓病情发展的三大治疗方法。此外,还有一些专门改善症状的对症治疗。如对合并焦虑的患者可使用“5羟色胺再摄取抑制剂”、失眠的患者可使用新型抗失眠药如“左匹克隆”或“思诺思”,不建议使用安定类药物,因为后者可加重肌无力、抑制呼吸。口水增多可使用“阿米替林”或“654-2”以减少唾液分泌,前者同时有抗焦虑抑郁作用,但这类药副作用较大,建议在医生指导下使用。疼痛患者可使用“芬必得”等非甾体抗炎药。痰多不易咳出患者可使用化痰药、咳痰机辅助咳痰等。针对ALS可能的各种机制,曾经进行过各种药物临床试验,较为著名的有“锂剂”、“头孢曲松”、“集落细胞刺激因子”、“特殊类型的免疫调节剂”等,但均已失败告终。今年的ALS年会报道一种叫做NP001的寡核苷酸调节剂可能对ALS有效,但还未经过大规模临床验证。由于迄今为止,ALS的发病机制仍不清楚,因此治疗方面还有很长的路要走。特别需要指出的是,一些所谓的宣称可以治疗甚至治愈ALS的方法,均未得到临床证实,最为著名的就是“干细胞移植”。卫生部早在2008年即专门发表声明,指出我国未批准干细胞移植应用于血液病治疗之外的任何领域。“干细胞治疗”确实拥有广阔前景,但在细胞移植通路、细胞存活和生长分化途径等诸多方面的问题均未解决,不是简单通过输液或腰穿或立体定向移植就能获得成功的。对于少数国家批准的,获得国家资助的干细胞移植研究,均是免费的,并会向家属充分告知可能面临的风险。目前,少数医院或医生却大肆宣传干细胞移植效果,吸引患者花巨资进行所谓的干细胞移植,不但看不到任何效果,还承受了巨额经济损失,最重要的是失去了宝贵的治疗时机。由于我国特殊的体制,卫生部门对这些医院不能进行监管。与此相类似的还有许多自创的所谓各种疗法,例如“神经再生”、“神经修复”等等,无不以招揽病人、骗取钱财为第一要务,提醒广大患者及患者家属不要上当。对于中医,其对疾病的认识和治疗理念与西医完全不同,西医是辨病论治,而中医是辩证论治。ALS在中医属于“痿证”,也属于较难医治的症候,如果辩证准确,我们不否认中医对ALS可能具有一定治疗效果,也不反对患者中西医结合治疗。但由于中医的玄妙,容易被人利用,因此提醒患者一定要到正规的公立三甲医院就诊。识别伪中医的方法是:如果不给方子、不允许患者自行到药店买药而只能在医院拿药,那一定是骗人的。在生活护理方面,ALS患者要注意适当活动,以不劳累为准,不要进行大运动量的锻炼,避免外伤,保持心情愉快,乐观的态度对延缓疾病发展很有帮助。2014年07月03日 14266 11 3
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2008年01月13日 116 0 0
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